Septinas são proteínas pertencentes à família das GTPases que estão envolvidas em uma variedade de funções celulares. Verificamos através de análises bioinformáticas que Schistosoma mansoni, um dos principais agentes etiológicos da esquistossomose, possui quatro genes que codificam septinas (SmSept5, SmSept10, SmSept7.1 e SmSept7.2). O objetivo deste trabalho foi a produção heteróloga das proteínas codificadas por estes genes, visando estudos estruturais e funcionais das mesmas. As septinas SmSEPT5 e SmSEPT10 foram expressas em sistema recombinante e foi possível a obtenção de formas solúveis destas proteínas. Experimentos de gel filtração e cross-linking mostraram que elas são diméricas em solução e estáveis em ampla faixa de pH, embora agregados proteicos tenham sido observados com o aumento da temperatura. Ambas as proteínas foram capazes de ligar GTP e GDP, embora apenas SmSEPT5 tenha apresentado atividade GTPásica. Mg2+ se mostrou essencial para a ligação de GTP a ambas as proteínas, enquanto a ligação do GDP foi independente da presença deste cofator. Ensaios de cristalização com o domínio GTPase de SmSEPT10 resultaram em cristais de ótima qualidade cuja difração resultou na obtenção da estrutura com melhor resolução alcançada até o momento para septinas: 1.9 Å para a forma ligada a GDP e 2.1 Å para a forma ligada a GTP. A análise da sobreposição das estruturas obtidas resultou na observação do deslizamento de uma fita β em relação às demais, que acreditamos estar envolvido com o mecanismo de associação destas proteínas à membranas. Um sistema de coexpressão foi construído em que SmSEPT5, SmSEPT10 e SmSEPT7.2 foram coexpressas e copurificadas, resultando na verificação da formação de hetero-oligômeros e filamentos por estas proteínas. Tratamento de diversas fases do ciclo de vida do parasito com um composto (FCF) que afeta a dinâmica de filamentos de septina, resultou em um fenótipo reversível de paralisia no parasito. Estudos de imunolocalização revelaram a colocalização de septinas e actina em fibras musculares do parasito, sugerindo que a interação entre filamentos de septina e actina pode ter um papel importante nas funções motoras do parasita. A imunolocalização revelou ainda a presença de septinas em placas epiteliais ciliadas de miracídios, células germinativas de miracídios e esporocistos e protonefrídios de cercárias. Os resultados apresentados aqui constituem a primeira descrição de septinas em platelmintos e nos possibilitam o estabelecimento de correlações estruturais e funcionais entre septinas de S. mansoni e complexos análogos de septinas de outros organismos, contribuindo para a elucidação da função desta família de proteínas. / Septins belong to the GTPase family of proteins and are involved in a variety of cellular processes. We have identified four genes encoding septins in Schistosoma mansoni, one of the main causative agents of schistosomiasis, these genes were named SmSept5, SmSept10, SmSept7.1 e SmSept7.2. The aim of this study was to clone the cDNA of these genes in order to subject the resulting proteins to a set of biophysical and functional studies. Biophysical characterizations were undertaken with SmSEPT5 and SmSEPT10 because of the higher solubility of these proteins, which were dimeric in solution and stable over a wide range of pH, although increasing temperatures promoted the aggregation of these proteins. The nucleotide binding assays revealed that both were capable of binding GTP and GDP, although only SmSEPT5 presented GTPase activity. Mg2+ has shown to be essential for GTP binding in both proteins while GDP binding was independent of this cofactor. Crystallization assays with the GTPase domain of SmSEPT10 have resulted in crystals of high quality and consequently high resolution structures were obtained: 1.9 Å to the GDP bound form and 2.1 Å to the GTP bound form, the best resolution achieved to date for any septin member. The sobreposition of the structures obtained enabled us to observe a strand slippage in β3 strand suggesting that it might be part of an activation mechanism involved in the association of these proteins to membranes. A coexpression system was produced, in which SmSEPT5, SmSEPT10 and SmSEPT7.2 were coexpressed and copurified. These proteins were able to assemble into heterocomplexes that further polymerize into filaments. Functional studies performed with a drug (FCF) that affects the dynamics of septin filaments have resulted in a reversible paralysis phenotype in the parasite. Immunolocalization experiments revealed the colocalization of septins and actin in muscular structures of the parasite, suggesting that the interaction of septin and actin filaments might have an important role in the motor activity of the parasite. The immunolocalization also revealed the presence of septins in the ephitelial plates of miracidia, germ cells of miracidia and sporocysts and protonephridia of cercariae. The results presented here constitute the first description of septins in phatyhelmintes and enabled us the establishment of structural and functional relaltionships among septins from S. mansoni and analogous septin complexes in other organisms, contributing to elucidate the function of this family of proteins.

Septinas são GTPases consideradas como um novo componente do citoesqueleto. Essas proteínas interagem entre si para formar heterocomplexos filamentosos e estruturas de alta ordem que são importantes para a citocinese e uma variedade de outros processos celulares. Existem muitos aspectos mecânicos dessas proteínas que não são totalmente compreendidos, incluindo a forma como os heterocomplexos se agrupam corretamente. Em humanos, há 13 genes que codificam septinas, classificadas em quatro grupos quanto à similaridade em relação à estrutura primária. O complexo hexamérico SEPT7-SEPT6-SEPT2-SEPT2-SEPT6-SEPT7 foi o melhor caracterizado, com uma estrutura cristalina resolvida à 4 Å. Segundo às Regras de Kinoshita, as septinas desse complexo podem ser substituídas nesse arranjo por outras pertencentes ao mesmo grupo. Neste trabalho utilizamos a técnica de microscopia eletrônica de transmissão com análise de partícula única para estudar dois complexos de septinas. Um dos complexos estudados neste projeto é formado por septinas humanas, para as quais atualmente não há informações estruturais disponíveis. O complexo SEPT5-SEPT6-SEPT7 foi expresso heterólogamente em E. coli e purificado em alta concentração salina para evitar a polimerização. A análise de partículas únicas de imagens por contrastação negativa mostrou a presença de partículas alongadas de aproximadamente 25 nm de comprimento, compostos por seis monômeros, como esperado. Com o objetivo de localizar a posição da SEPT5 no complexo, foi realizada uma fusão com MBP (Maltose Binding Protein) e imunomarcação com anticorpo monoclonal anti-SEPT5, concluindo que a SEPT5 está localizada na extremidade do complexo hexamérico. Porém, a SEPT5 pertence ao mesmo grupo da SEPT2, que foi relatada estar localizada no centro do hexâmero. Este resultado possibilitou uma nova discussão sobre a maneira que as septinas formam os complexos e, como a sensibilidade à concentração salina está relacionada com a fragilidade da interface NC, análogo ao observado em complexos de Saccharomyces cerevisiae. Um complexo de Ciona intestinalis incluindo a SEPT2, SEPT6, SEPT7 e SEPT9, também expresso heterólogamente em E. coli, foi preparado por contrastação negativa. A análise de partícula única das imagens coletadas mostrou um heterocomplexo aparentemente hexamérico, embora fosse esperado um octâmero devido à presença das quatro septinas diferentes, sendo uma pertencente à cada um dos quatro grupos. Os resultados deste trabalho proporcionaram um avanço na compreensão da formação de heterocomplexos de septinas e como essas proteínas interagem umas com as outras nesta montagem. / Septins are GTPases that appear to be a novel component of the cytoskeleton. These proteins interact with each other to form filamentous heterocomplexes and high order structures which are important for cytokinesis and a variety of other cellular processes. There are many mechanistic aspects of these proteins that are not fully understood, including how the heterocomplexes correctly assemble. In humans, there are 13 genes encoding septins, classified in four groups based on primary structure. The SEPT7-SEPT6-SEPT2-SEPT2-SEPT6-SEPT7 hexameric complex was the best characterized, with a crystalline structure solved at 4 Å. According to Kinoshita´s Rules, the septins of this complex can be replaced in this arrangement by others belonging to the same group. In this work, we used transmission electron microscopy with single particle analysis to study two septin complexes. One of the complexes studied in this project is composed of three human septins, for which there is currently no structural information available. The SEPT5-SEPT6-SEPT7 complex was heterologously expressed in E. coli and purified at high salt concentration to avoid polymerization. Single particle analysis of negatively stained samples showed the presence of elongated particles of approximately 25 nm in length. To locate SEPT5 in the complex, a fusion with MBP (Maltose Binding Protein) and immunoblotting with anti-SEPT5 monoclonal antibody was performed, concluding that SEPT5 is located at the end of the hexameric complex. However, SEPT5 belongs to the same group as SEPT2, which was reported to be located in the center of the hexamer. This result allowed for a new discussion on the way that septins form heterocomplexes and also, on how the sensitivity of the NC interface in related to salt concentration, analogous to that observed in the heterocomplex of Saccharomyces cerevisiae. A Ciona intestinalis complex including SEPT2, SEPT6, SEPT7 and SEPT9, also expressed heterologously in E. coli, was prepared by negative staining. The single particle analysis of the collected images showed an apparently hexameric heterocomplex, although an octamer was expected due to the presence of the four different septins, one belonging to each of the four groups. The results of this work represent advances in the understanding of the formation of septin heterocomplexes and how these proteins interact with each other during assembly.

As septinas constituem uma conservada família de proteínas de ligação a nucleotídeos de guanina e formação de heterofilamentos. Em mamíferos, tais proteínas estão envolvidas em uma variedade de processos celulares tais como citocinese, exocitose e tráfego de vesículas. A SEPT4 tem sido identificada em depósitos filamentosos e inclusões citoplasmáticas em Alzheimer e doença de Parkinson, respectivamente. A SEPT4 é a única proteína em associação com proteínas aberrantes em depósitos em ambos os tipos de doenças Assim, estudos adicionais de propriedades bioquímicas estruturais e funções fisiológicas para a SEPT4 podem promover importantes insights em relação ao mecanismo das doenças neurodegenerativas citadas acima. O desenovelamento térmico do domínio GTPase do SEPT4-G revelou um intermediário que agrega rapidamente na forma de fibras tipo amilóide em condições fisiológicas. Neste estudo a análise cinética da agregação do SEPT4-G foi monitorada utilizando fluorescência extrínseca e dicroísmo circular. Com os resultados e análises realizados durante este trabalho de mestrado foi possível compreender com mais detalhes a cinética de formação de agregados tipo amilóide do domínio SEPT4-G. Este trabalho também descreve a cristalização, coleta de dados, resolução e refinamento do modelo cristalográfico para a enzima Glutationa-S-Transferase de Xylella fastidiosa. Tal enzima está associada à patogenicidade da bactéria X. fastidiosa, responsável por várias doenças em plantas economicamente importantes, incluindo a Clorose Variegada dos Citros (CVC) ou Amarelinho. Algumas análises também foram realizadas após a obtenção do modelo cristalográfico demonstrando as diferenças estruturais entre GSTs bacterianas. / The septins are a conserved family of guanine nucleotides-binding and hetero-filament forming. proteins. In mammals they are involved in a variety of cellular processes, such as cytokinesis, exocytosis, and vesicle trafficking. SEPT4 has been reported to accumulate in tau-based filamentous deposits and cytoplasmic inclusions in Alzheimers and Parkinsons diseases respectively. Sept4 is unique in its association with the aberrant protein depositions in both types of diseases. Further studies on the biochemical, structural properties and physiological functions of Sept4 may therefore provide important insights into the common mechanism underlying diverse neurodegenerative disorders. Thermal unfolding of the GTPase domain of SEPT4 (SEPT4-G) revealed an unfolding intermediary which rapidly aggregates into amyloid-like fibers under physiological conditions. In this study, the kinetic analysis of aggregation of SEPT4-G was monitored using extrinsic fluorescence and circular dichroism spectroscopy. The aggregates have the ability to bind specific dyes such as Thioflavin-T (ThT), suggesting that they are amyloid in nature. Fibrils formation was monitored by the increase in ThT emission and electron microscopy as a function of temperature, pH, metal ions and protein concentration. Glutathione S-transferases (GSTs) form a group of multifunctional isoenzymes that catalyze the glutathione-dependent conjugation and reduction reactions involved in the cellular detoxification of xenobiotic and endobiotic compounds. GST from Xylella fastidiosa (XfGST) was crystallized by the vapour-diffusion method and its crystallography structure was solved for molecular replacement and refined. Afterwards, sequential and structural analyses were carried out for XfGST and others GSTs.

Septinas constituem uma família conservada de proteínas de citoesqueleto pertencentes à superclasse das P-loop GTPases. Tais proteínas estão envolvidas em vários processos celulares. Em humanos, algumas septinas também estão relacionadas a casos de patologia. Suas seqüências são divididas em três domínios: domínio N-terminal, domínio GTPase e domínio C-terminal, que geralmente possui predição de coiled coil. A principal característica da família está na capacidade de seus membros formarem filamentos compostos por septinas diferentes. Em 2007, Sirajuddin et al apresentaram a primeira e única estrutura cristalográfica de um complexo de septinas, formado pelas septinas 2, 6 e 7. Embora os domínios C-terminal estivessem presentes, eles não apresentaram densidade eletrônica. Assim, a estrutura não trouxe informação estrutural sobre tais domínios. Atualmente, existem quatro estruturas de septinas depositadas no PDB: complexo 2/6/7 e três estruturas SEPT2 sem o C-terminal. Dada a inexistência de informações estruturais a nível atômico para os domínios C-terminal e baixa qualidade das poucas estruturas existentes, propusemos a obtenção de informações bioquímicas e estruturais dos domínios C-terminal de septinas humanas e a obtenção da estrutura cristalográfica de SEPT3-GC (GTPase mais C-terminal). Vale ressaltar que SEPT3 pertence ao único grupo de septinas que possui predição de não apresentar um coiled coil no C-terminal e para o qual não há nenhuma estrutura disponível. Expressamos e purificamos os domínios C-terminal de SEPT2, SEPT6 e SEPT7 (SEPT2-C, SEPT6-C e SEPT7-C). Mostramos que eles formam homo dímeros e que SEPT6-C e SEPT7-C formam um hetero dímero (KD 15,8 nM), nomeado por SEPT67-C. Tanto SEPT6-C quanto SEPT7-C tendem a precipitar, ao passo que SEPT67-C e SEPT2-C (KD 4 μM) são estáveis à altas concentrações. Tentamos, sem sucesso, cristalizar SEPT2-C e SEPT67-C. Via ressonância magnética nuclear, vimos que SEPT2-C possui duas regiões dinamicamente diferentes, uma central, em α-hélice, e duas extremidades desestruturadas. Neste ponto, planejamos construções para as regiões centrais dos domínios C-terminal, nomeadas SEPT2-CC, SEPT4-CC, SEPT6-CC e SEPT7-CC, referente às septinas 2, 4, 6 e 7. Obtivemos cristais para SEPT2-CC, SEPT4-CC e SEPT6-CC. Contudo, resolvemos apenas a estrutura de SEPT4-CC, mostrando que a construção forma um coiled coil anti-paralelo. Então, propusemos, pela primeira vez, um possível mecanismo de formação de ligações cruzadas entre filamentos de septinas. Por outro lado, obtivemos cristais para uma construção contendo os domínios GTPase e C-terminal de SEPT3 (SEPT3-GC) e resolvemos sua estrutura (2,9 Å). Vimos que SEPT3-GC forma filamentos no cristal, utilizando as mesmas duas interfaces já descritas anteriormente para as outras estruturas. Comparamos a estrutura obtida com estruturas da literatura e observamos diferenças significativas em algumas regiões, além de diferença em relação à orientação das duas subunidades adjacentes. Deve ser notado que a estrutura de SEPT4-CC é a primeira estrutura de um coiled coil de septina e que a estrutura de SEPT3-GC é a primeira estrutura de uma septina do grupo I. Em conclusão, o presente trabalho apresentou um conjunto de resultados os quais auxiliará no entendimento desta intrigante família de proteínas, inclusive em relação à formação de filamentos e as interações entre estes. / Septins are a conserved family of cytoskeletal proteins belonging to the superclass of the Ploop-GTPases, involved in various cellular processes. In humans, some septins are also linked to cases of pathology. Their sequences are divided into three domains: an N-terminal domain, a GTPase domain and a C-terminal domain, which usually is predicted to form a coiled coil. The main feature of the family is the ability of its members to form filaments composed of different septins. In 2007, Sirajuddin et al presented the first and only crystal structure of acomplex of septins, formed by septins 2, 6 and 7. Although the C-terminal domains were present, they showed no electron density, indicating disorder. Thus, this structure provides little structural information concerning their nature. Currently, there are four septin structures deposited in the PDB: the 2/6/7 complex and three structures of SEPT2 lacking the Cterminal domain . Based on the absence of structural information at atomic resolution about the C-terminal domains and the low quality of the few existing structures we set out to characterize both biochemically and structurally the C-terminal domains of selected human septins as well as to obtain the crystal structure of SEPT3-GC (a construct containing the GTPase and C-terminal domains). It is noteworthy that SEPT3 belongs to the only group of septins that are predicted to lack the C-terminal coiled coil and for which no crystal structure is available. We have expressed and purified the C-terminal domains of SEPT2, SEPT6 and SEPT7 (SEPT2-C, SEPT6-C and SEPT7-C). We show that they form homo-dimers and that SEPT6-C and SEPT7-C form a hetero-dimer (KD 15.8 nM), SEPT67-C. Both SEPT6-C and SEPT7-C were unstable, but SEPT67-C and SEPT2-C (KD 4 μM) were both stable at high concentrations. NMR measurements showed that SEPT2-C has two dynamically different regions, a central one which is -helical, and two extremities which are unstructured. Constructs were designed for the central regions of the C-terminal domains of septins 2, 4, 6 and 7 (SEPT2-CC, SEPT4-CC, SEPT6-CC and SEPT7-CC). We have obtained crystals of SEPT2-CC, SEPT4-CC and SEPT6-CC and have solved the structure of SEPT4-CC which unexpectedly is observed to form an anti-parallel coiled coil. We use this observation to propose, for the first time, a possible mechanism for the formation of cross-links between septin filaments. Crystals were obtained for SEPT3-GC its structure solved at 2.9 Å. We observe that SEPT3-GC forms filaments in the crystal, employing the same two interfaces previously described for other structures. We compare the structure obtained with those from the literature and observe significant differences in some regions of the molecule as well as differences in the relative orientation of the subunits. It should be noted that the structure of SEPT4-CC is the first structure of a septin coiled coil and that the structure of SEPT3-GC is the first structure of a septin from group I. In conclusion, this study presentsm results which will assist in the understanding of this intriguing protein family, including observations pertinent to filament formation and cross-linking.

Septinas são proteínas que pertencem a super família das GTPases e que foram inicialmente identificadas em Saccharomyces cerevisae, mas logo em seguida, também em eucariotos superiores, exceto em plantas. Estas proteínas estão envolvidas em uma variedade de processos celulares tais como segregação de cromossomos, polaridade celular, dinâmica da membrana, tráfego de vesículas, exocitose, apoptose, entre outros. Mutações ou alterações no padrão de expressão de septinas são associadas com vários cânceres e doenças neurológicas. Objetivando contribuir com informações funcionais sobre tais proteínas, as septinas humanas 1, 5 e 7 foram usadas como iscas em ensaios de duplo híbrido em leveduras visando à identificação de seus parceiros protéicos. Após a varredura de bibliotecas de cDNA de leucócitos e cérebro fetal humano, os parceiros protéicos predominantemente encontrados foram outras septinas de grupos diferentes aos das iscas. As interações septina-septina envolveram o domínio de ligação a GTP. Ainda, outros parceiros, diferentes de septinas, foram também identificados nas bibliotecas e estes se mostraram funcionalmente relacionados à endocitose, à regulação da atividade de GTPases, ao tráfego intracelular, aos ciclos de sumoilação, à manutenção da placa metafásica e à maturação do centrossomo. Algumas destas funções são inéditas e foram pela primeira vez relacionadas às septinas. Este trabalho também esteve voltado à caracterização biofísica das septinas 3 e 5 (SEPT3 e SEPT5). Muitos protocolos diferentes foram desenvolvidos na tentativa de obter amostras homogêneas de SEPT5, mas não foram bem sucedidos. Por outro lado, SEPT3 recombinante, destituída do domínio amino-terminal (SEPT3GC) foi eficientemente produzida em E. coli. O estado monomérico de SEPT3GC em solução foi confirmado por cromatografia de exclusão molecular e espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS). SEPT3GC mostrou-se ativa e capaz de hidrolizar GTP in vitro. A afinidade de SEPT3GC por GTPγS e GDP foi avaliada por calorimetria de titulação isotérmica (ITC), sendo que o KD de SEPT3GC para GTPγS foi de 5,43 μM e a ligação para este nucleotídeo foi dependente de Mg2+. A ligação para GDP não foi detectável. Agregados de SEPT3GC induzidos por temperatura foram capazes de ligar a sonda fluorescente tioflavina-T, sugerindo uma natureza amilóide para tais estruturas. / Septins are proteins that belong to the superfamily of GTPases, which were initially identified in Saccharomyces cerevisiae, and then in higher eukaryotes, except plants. These proteins are involved in a variety of cellular processes such as chromosome segregation, cell polarity, membrane dynamics, vesicle trafficking, exocytosis, apoptosis, among others. Mutations or changes in the expression of septins have been associated with various cancers and neurological diseases. Aiming to provide functional information about these proteins, the human septins 1, 5 and 7 were used as baits in yeast two-hybrid assay in order to identify their protein partners. After screening cDNA libraries from human leukocytes and fetal brain, the protein partners predominantly found were septins from others groups. The septin-septin interactions involved the GTP binding domain. Others non-septins interactors have also been identified in the libraries and were functionally related to endocytosis, the regulation of the GTPase activity, intracellular trafficking, sumoylation, maintenance of metaphase plate and centrosome maturation. Some of these functions are new and were related to the septins for the first time. This work also focused on the biophysical characterization of the septins 3 and 5 (SEPT3 and SEPT5). Many different protocols were developed aiming to obtain homogeneous samples of SEPT5, but were not successful. On the other hand, recombinant SEPT3, without the amino-terminal domain (SEPT3GC), was produced in a homogeneous form in E. coli. SEPT3GC is monomeric in solution as confirmed by size exclusion chromatography and small-angle X-ray scattering (SAXS). Also, SEPT3GC has shown to be active and able to hydrolyze GTP in vitro. The SEPT3GC affinity by GTPγS and GDP were evaluated by isothermal titration calorimetry (ITC). The KD for GTPγS was about 5,43 μM and it was observed to be Mg2+ dependent. The binding to GDP was not detectable. SEPT3GC aggregates induced by temperature were able to bind the thioflavin-T fluorescent probe, suggesting an amyloid nature for such structures.

Neste trabalho estudamos por espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) quatro diferentes sistemas de interesse biológico. Visamos investigar a auto-agregação de proteínas e de complexos proteicos que darão origem a fibras amilóides, interação proteína-proteína, simulando ambientes altamente concentrados, interação proteína-membrana simulando vesículas de matriz extracelular (MVs) de sistemas de biomineralização e interações proteína-agentes desnaturantes. No caso de formação de amilóides, investigamos a agregação do domínio GTPase da septina 6 (SEPT6G) e do complexo formado com o domínio GTPase da septina 2 (SEPT2G-SEPT6G). A temperaturas de até 15°C, tanto SEPT6G quanto SEPT2G-SEPT6G apresentam-se predominantemente diméricas em solução. Já a 25°C, o heterodímero SEPT2G-SEPT6G permanece estável enquanto agregados maiores de SEPT6G evoluem e coexistem em solução com SEPT6G-SEPT6G dimérica, sendo que a proporção de dímeros diminui com a temperatura. No estudo das MVs, mostramos que miméticos lipossomais de DPPC e DPPC:DPPS (9:1) possuem as mesmas características estruturais na ausência e presença de cálcio na solução. A interação da proteína anexina V humana (A5), envolvida em processos de biomineralização, impacta na membrana modelo induzindo a formação de nanoporos. A adição da fosfatase alcalina tecido não-específico (TNAP) não altera as propriedades estruturais do proteolipossomo na presença de A5. A ação do surfactante dodecil sulfato de sódio (SDS) a 30 mM não altera a conformação da albumina soro bovina (BSA), de maneira que é observada a formação de micelas de SDS coexistindo com a proteína livre em solução. Já a adição de 50 mM de SDS induz um desenovelamento parcial da proteína, identificado pela análise das curvas de SAXS via modelo de \"colar de pérolas\". A ação de uréia a 3 M e 8 M promove um desenovelamento parcial e total da BSA, respectivamente, com subsequente agregação de proteína dependente da temperatura (T > 30°C). A adição de 6 mM de SDS em proteínas parcialmente desenoveladas pela ação da uréia promove um desenovelamento mais acentuado. O potencial efetivo resultante da interação entre duas proteínas distintas, BSA e lisozima a concentração total de 100 mg/mL em solução, pH 7.0, foi obtido da análise de curvas de SAXS. Para isto, utilizou-se uma análise simplificada (em primeira aproximação) considerando um potencial efetivo de interação entre BSA-BSA, lisozima-lisozima e lisozima-BSA. Variamos a razão molar BSA:LISO até 1:42. No pH estudado, BSA tem uma carga residual superficial de -11e, enquanto a lisozima possui +9e. Conforme variamos a razão molar BSA:LISO, observamos dois regimes para o potencial efetivo resultante: i) até BSA:LISO 1:2, a carga efetiva do sistema é praticamente nula com um potencial resultante de caráter atrativo e ii) para razões entre BSA:LISO 1:3 a 1:42, a carga efetiva aumenta e o potencial resultante tem caráter repulsivo. Assim, lisozima e BSA coexistem sem agregar, através de um delicado balanço de forças atrativas e repulsivas no sistema. / In this work we have used small-angle x-ray scattering (SAXS) to study four systems of biological interest. We aim to investigate the self aggregation of proteins and protein complexes that would form amyloid fibers; protein/protein interaction, simulating high concentrations; protein/cell-membrane interaction, simulating extracellular matrix vesicles (MVs) from biomineralizing systems; and protein/denaturating-agents interactions. On the case of amyloid formation, we have investigated the aggregation of G-domain of septin-6 (SEPT6G) and the protein complex formed with G-domain of septin-2 (SEPT2G-SEPT6G). At temperatures lower than 15°C, both SEPT6G and SEPT2G-SEPT6G were found predominantly as dimers. At 25°C, SEPT2G-SEPT6G heterodimer is still stable while aggregates of SEPT6G grow. Both coexist in solutions of SEPT2G-SEPT6G dimers, with the percentage of dimers decreasing the higher the temperature. As for the study of MVs, we have shown that DPPC and DPPC:DPPS (9:1) liposomal mimetics have the same structural characteristics at the absence or presence of Calcium. The interaction with human annexin V protein (A5), related to biomineralization processes, affects the model membrane by the creation of nanopores. The addition of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) does not change the structural properties of the proteoliposome when A5 is present. The addition of SDS surfactant (30 mM) does not alters the conformation of bovine serum albumin (BSA), and we have observed the formation of SDS micelles coexisting with free protein in solution. The addition of 50 mM of SDS, on the other hand, induces the partial unraveling of the protein, as seen by the analysis of SAXS data via the pearl necklace\'\' model. The effect of adding 3M and 8M urea is, respectively, the partial and total unraveling of BSA, with ensuing aggregation of the protein dependent on the temperature (T > 30°C). The introduction of SDS 6mM promotes further unraveling in proteins that were previously partially unraveled by urea. The resulting effective potential for the interaction between BSA and lysozyme at total concentration of 100mg/ml and 7.0 pH has been obtained from the analysis of SAXS curves. In order to obtain this result we have used a simplified analysis (first order approximation) in which were considered the effective potentials for the interactions between BSA-BSA, lysozyme-lysozyme and lysozyme-BSA. We have varied the BSA:LISO molar ratio up to 1:42. At the studied pH, BSA has a surface residual charge of -11e, and lysozyme has +9e. As we changed the BSA:LISO molar ratio, we have found two regimens for the resulting effective potential: i) up to BSA:LISO 1:2, the effective charge of the system is virtually zero and the resulting potential is attractive; and ii) for BSA:LISO between 1:3 and 1:42 the effective charge increases, and the resulting potential is repulsive. Therefore, both lysozyme and BSA coexist without forming aggregates, by a delicate balance of attractive and repulsive forces.

Septinas compreendem uma conservada família de proteínas de ligação a nucleotídeo de guanina e formação de heterofilamentos. Em termos estruturais, elas possuem uma organização comum: um domínio GTPase central, uma região N-terminal e um domínio C-terminal, este último é predito para formar estruturas em coiled coil. Atualmente, o heterocomplexo de septinas humanas (SEPT2/SEPT6/SEPT7) mais bem caracterizado revela a importância do domínio GTPase na formação do filamento, todavia a ausência de densidade eletrônica para os domínios C-terminais faz com que sua função permaneça obscura. Estudos com septinas de mamíferos, e de outros organismos como C. elegans e S. cerevisea sugerem que alguns grupos de septinas (por exemplo, II e IV em mamíferos) interagem através de seus domínios C-terminais, e estes poderiam atuar de modo determinante para a montagem correta do filamento. Assim, o presente projeto objetivou estudar a afinidade homo/heterotípicas para os domínios C-terminais das septinas humanas dos grupos II (SEPT6C/8C/10C/11C) e IV (SEPT7C), investigando se esses domínios contribuem para preferência das septinas interagirem com proteínas de grupos distintos durante a formação do heterofilamento. Os domínios C-terminais foram expressos em E. coli e purificados. Foram conduzidos estudos de ultracentrifugação analítica e espectropolarimetria de dicroísmo circular, que permitiram identificar maior afinidade e estabilidade da associação heterotípica comparada à homotípica. Foram obtidas constantes de dissociação aparente para homodímeros em torno de baixo µM, enquanto que para heterodímeros os dados já existentes no grupo revelaram constante de dissociação na ordem de nM. Para entender os fatores no nível atômico responsáveis pela significativa predileção na interação entre os domínios C-terminais dos grupos II e IV foram realizados estudos utilizando modelagem e análise das sequências primárias. As análises sugerem a presença de um alto número de resíduos carregados na posição a do coiled coil como responsável pela seletividade. Consequentemente, o heterodímero seria favorecido em virtude do menor efeito repulsivo proveniente do intercalamento dos resíduos carregados em a. Desse modo, os resultados indicaram a atuação decisiva ou cooperativa dos domínios C-terminais na organização preferencial das septinas durante a formação do filamento, favorecendo a interface NC entre septinas dos grupos II e IV. / Septins comprise a conserved protein family that binds guanidine nucleotide and forms heterofilaments. In structural terms they have a common organization: a central GTPase domain, a N-terminal domain and a C-terminal domain, this last one is predicted to form coiled coil structures. Currently, the human septin heterocomplex best characterized (SEPT2/SEPT6/SEPT7) reveals the importance of the GTPase domain in filament assembly, however the absence of electron density for the C-terminal domains makes its function still unknown. Studies with mammals septins, and of others organisms like C. elegans and S. cerevisea suggests that some septins groups (e.g. II e IV in mammals) interact via its C-terminal domains and this could act in a determinative way to correct filament assembly. In this way, this project aimed to study the homo/heterotypical affinity for the C-terminal domains of human septins belonging to groups II (SEPT6C/8C/10C/11C) e IV (SEPT7C), investigating whether this domain contributes with the preference of septins to interact with proteins of different groups during assembly of the heterofilament. The C-terminal domains were expressed in E. coli and purificated. It was carried out studies using analytical ultracentrifugation and circular dichroism spectropolarimetry tecniques which allowed identification of major affinity and stability in the heterotypical association compared to homotypical. It was measured apparent dissociation constants for homodimers of low µM range while for heterodimers our group\'s data shows dissociation constants in the nM range. To understand at atomic level the factors responsible for this significant preference in the C-terminal domains interaction between groups II and IV was performed molecular modelling studies and analysis of the primary sequence. These analysis suggests the presence of a high number of charged residues in position a of the coiled coil as responsible for selectivity. Consequently, the heterodimer would be therefore favoured because of the minor repulsive effect coming from the staggered of charged residues in a. Thus, these results indicate the crucial or cooperative action of C-terminal domains in preferential organization of septins during filament assembly, favouring the NC interface between septins of groups II and IV.

Septinas compreendem uma conservada família de proteínas de ligação a nucleotídeo de guanina, capazes de formar filamentos. No entanto, apesar de sua importância em vários eventos celulares, ainda há pouca informação disponível no que diz respeita aos detalhes de suas funções moleculares e o mecanismo que conduz a formação de hetero-oligômeros. O objetivo desta tese foi a clonagem, co-expressão e cristalização de septinas e seus complexos (SEPT9-SEPT11-SEPT7; SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9; SEPT4-SEPT6-SEPT7 e SEPT4- SEPT8-SEPT7) seguidas por análise estrutural comparativa. Os cDNAs que codificam para as proteínas SEPT9, SEPT6, SEPT2, SEPT11, SEPT8, SEPT4, SEPT9GCα0 (resíduos 262-568) e SEPT9GC (resíduos 279-568) foram clonadas com sucesso em vetores de transferências ou de expressão. O complexo que foi melhor caracterizado, foi o composto por SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9GCα0, o qual foi confirmado por LC-MS/MS após digestão tríptica, revelando a produção in vitro de um complexo de septina tetramérico. Além disso, caracterizou-se o hetero dímero formado por SEPT7NGc-SEPT9GC. No entanto, as proteínas que foram mais plenamente investigadas foram as construções SEPT9GCα0 e SEPT9GC que foram estudados individualmente para caracterizações biofísicos e estruturais. SEPT9GCα0 apresentou-se bastante instável, porém, SEPT9GC foi eficientemente produzida e caracterizada. O estado oligomérico da proteína (monômero) foi confirmado por cromatografia de exclusão molecular. A proteína foi produzida na forma apo, e foi incapaz de hidrolisar GTP. A finidade de SEPT9GC pelos nucleotídeos GDP e GTPγS, foi avaliada por Calorimetria de Titulação Isotérmica -ITC, revelando que SEPT9GC possui uma maior afinidade por GTPγS, com Kd de 25,9 µM, o qual é dependente do íon Mg2+. Foram realizados estudos de cristalização dessa proteína, que resultou em cristais de alta resolução, com a proteína complexada a GDP e GTPγS. Interessantemente, a estrutura do complexo de SEPT9GC com o nucleotídeo GTPγS foi obtido por soaking de um cristal previamente obtido complexado com GDP. Este é o primeiro relatório da aplicação deste método para septinas. Finalmente, obtivemos três conjuntos de dados cristalográficos, dois para SEPT9GC-GDP, com resolução de 2.8 Å e 2.1Å e um conjunto de dados de SEPT9GC-GTPγS obtido a 2.8 Å. Dentre as principais características observadas na estrutura de SEPT9GC, tem-se a interface NC responsável pela polimerização dos filamentos, a qual se mostrou diferente dependendo do tipo de nucleotídeo ligado, com encurtamento do filamento na presença de GTPγS. Isso indica a comunicação entre as interfaces consecutivas G e NC ao longo do filamento. A mudança conformacional na interface envolve o rearranjo dos resíduos que são altamente conservados em todas as septinas, bem como alguns que são específicos do grupo de SEPT9 e podem ter implicações para a montagem de filamentos e de associação da membrana. / Septins belong to a highly conserved family of guanine nucleotide binding proteins, capable of forming filaments. Despite their importance for several critical cellular events including cell division, little information is available about their molecular functions and the mechanism which leads to the formation of hetero-oligomers. The aim of this thesis was the cloning, co-expression and crystallization of septins and their complexes (SEPT9-SEPT11-SEPT7; SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9; SEPT4-SEPT6-SEPT7 and SEPT4-SEPT8-SEPT7), followed by comparative structural analysis. The cDNAs coding for the proteins SEPT9, SEPT6, SEPT2, SEPT11, SEPT8, SEPT4, SEPT9GCα0 (residues 262-568) and SEPT9GC (residues 279-568) were successfully cloned into transferable or expression vectors. The best characterized complex was that composed of SEPT2-SEPT6-SEPT7-SEPT9GCα0, which was confirmed by LC-MS/MS analysis after triptic digestion, unveiling the in vitro production of a tetrameric septin complex. Additionally, we characterized the hetero-dimer formed by SEPT7NGc-SEPT9GC. However, the most fully investigated proteins were the constructs SEPT9GCα0 and SEPT9GC which were studied individually for biophysical and structural characterizations. SEPT9GCα0 was highly unstable contrasting with SEPT9GC that was efficiently produced and characterized. The presence of the oligomeric state of SEPT9GC (monomer) was confirmed by molecular exclusion chromatography. The protein was produced in the apo form and was capable of hydrolyzing GTP. The affinity of SEPT9GC for GDP and GTPγS nucleotides was evaluated by Isothermal Titration Calorimetry (ITC) revealing that SEPT9GC has a higher affinity for GTPγS, with a Kd of 25.9 µM, which is dependent on the presence of Mg2+. Crystallization studies of this protein were performed, obtaining high quality crystals of protein complexes with GDP and GTPγS. Interestingly, the structure of the complex of SEPT9GC with the nucleotide GTPγS was obtained by soaking a previously grown crystal of the GDP complex. This is the first report of the application of this method for septins. Finally, we have obtained three sets of crystallographic data, two for SEPT9GC-GDP, at resolutions of 2.8 Å and 2.1 Å, and one set of data for SEPT9GC-GTPγS at 2.8 Å. Among the main characteristics observed in the SEPT9GC structure is the NC interface responsible for filament polymerization, which is shown to vary according to the type of bound nucleotide, with foreshortening of the filament in the presence of GTPγS. This indicates communication between consecutive G and NC interfaces along the filament. The conformational change at the interface involves the rearrangement of residues which are highly conserved in all septins as well as several which are SEPT9 group specific and may have implications for filament assembly and membrane association.

Septinas são proteínas ligantes a GTP encontradas desde fungos até metazoários. A primeira função identificada para septinas foi o seu papel central na organização e dinâmica do septo de divisão de leveduras. Uma das características marcantes é que septinas se organizam em heterofilamentos de 7 a 9 nm de espessura que foram purificados de diversos organismos tais como Saccharomyces cerevisiae, Drosophila e cérebro de camundongos. Hoje se sabe que septinas não estão envolvidas apenas nos processos de divisão celular, mas em uma variedade de processos como tráfico de vesículas, exocitose, interação com proteínas do citoesqueleto e com a membrana plasmática, o que resulta em alterações da morfologia celular. Neste trabalho foram desenvolvidos estudos da septina 4 humana (SEPT4) nos quais foi realizado a expressão e purificação da SEPT4 pelo uso do sistema de expressão heteróloga em E. coli e em células de insetos (Sf-9) via baculovírus. A tentativa de expressão usando o vetor pETTEV em E.coli não obteve sucesso, pois a proteína não foi expressa na forma solúvel. A construção do baculovírus recombinante AcSept4 e expressão da SEPT4 nas células de insetos foi realizada com êxito, mas o processo de purificação não foi satisfatório. Com o intuito de obter informações sobre possíveis proteínas que interagem com a SEPT4 e conseqüentemente sobre as funções desempenhadas por ela na célula, a SEPT4 foi utilizada como isca para ensaios de interação proteína-proteína pela técnica de duplo híbrido. Para isso, o gene da SEPT4 foi clonado fusionado ao domínio de ligação ao DNA Lex-A. A realização do ensaio de duplo híbrido com a proteína completa não foi possível, pois a mesma provocou a auto ativação do sistema, por isso uma nova construção foi realizada com a região GTPase e C-terminal SEPT4GC (124-478) como isca. Dentre as interações identificadas, foram encontradas apenas septinas do grupo II (SEPT6, SEPT8, SEPT10 e SEPT11) e quatro novas interações, que ainda precisam ser confirmadas. Por outro lado, uma interação já descrita na literatura envolve a proteína &#945-sinucleína, que é uma proteína abundantemente expressa no cérebro e associada à doença de Parkinson. O foco do estudo dessa interação foi realizar ensaios com os diferentes domínios da SEPT4 para comprovar uma interação direta e com isso tentar mapear o sítio de interação com a &#945-sinucleína. Os resultados obtidos pela ressonância plasmônica de superfície (SPR) indicam que o domínio C-terminal participa da interação com baixa afinidade (K,D=390 &#181M) e sugerem que o domínio GTPase também pode estar envolvido. Já os dados obtidos com os experimentos de RMN e anisotropia de fluorescência mostram indícios que a interação é dependente da conformação da &#945-sinucleína por que a interação aconteceria com maior afinidade quando a &#945-sinucleína está na presença de SDS. / Septins are a family of GTP binding proteins found in a great diversity of organisms. These proteins have been identified as having a central role in septum organization during yeast division. Septins are organized into heterofilaments which are 7 to 9 nm wide and these have been purified from yeast, Drosophila and mice brain. Septins are not only required for cell division, but seem to play a role also in vesicle trafficking and in the formation of diffusion barriers within cells, since they interact with cytoskeleton proteins and the plasma membrane causing changes in cell morphology. In the present work, the aim was investigate human Septin 4 (SEPT4), a septin highly expressed in the brain. One objective of this work was to find a suitable expression system and purification method for SEPT4. The protein was expressed in both E.coli and insect cells (Sf-9). Expression in E. coli with the vector pETTEV was unsuccessful because the protein was insoluble. Expression in insect cells using the recombinant baculovirus AcSept4, was obtained successfully, but the purification was difficult. Important information concerning SEPT4 function might be acquired, if interactions partners involved in cellular process were identified. With this goal in mind, a yeast two hybrid assays were performed. The sept4 gene was fused to the Lex-A DNA binding domain and used as bait in the yeast two hybrid essays. However, full length SEPT4 showed autonomous activation of reporter genes. A second construct was prepared including only GTPase domain and the carboxy terminus domain, (residues 124 to 478) and the screen of interactions were carried out only with SEPT4GC. All of the group II septins (SEPT6, SEPT8, SEPT10 and SEPT11) were identified together with four new interactions. The latter still need be confirmed. In addition, another interaction already described in the literature is between SEPT4 and &#945-synuclein, which is a protein highly expressed in brain and related to Parkinson\'s disease. Different spectroscopic methods and SPR were used to identify which domain of SEPT4 interacts directly with &#945-synuclein and in which region. The surface plasmon resonance (SPR) results indicate that the carboxy terminus participates in the interaction with low affinity (KD = 390 &#181M) and suggests that the GTPase domain may also be involved. The results obtained by fluorescence anisotropy and NMR studies provide evidence that the interaction is dependent on the &#945-synuclein conformation, because the affinity of SEPT4 and &#945-synuclein seemed to be higher in the presence of SDS.

Septinas abrangem uma família conservada de proteínas que ligam e hidrolisam GTP e formam heterofilamentos, anéis e redes para realizar as suas funções. Apresentam três domínios estruturais: o domínio N-terminal contendo uma sequência polibásica (para ligar membranas), o domínio de ligação ao nucleotídeo (G) e o domínio C-terminal que inclui uma sequência predita de formar um coiled-coil. Em humanos, as 13 septinas são classificadas em quatro grupos (I, II, III e IV) baseadas nas sequências de aminoácidos. O único filamento caracterizado estruturalmente, até hoje, é o formado por SEPT2-SEPT6-SEPT7, mostrando que as subunidades interagem através de duas interfaces (chamadas G e NC). Os determinantes estruturais da montagem correta do filamento são pouco conhecidos, sendo o estudo limitado pela complexidade em purificar e cristalizar complexos triméricos ou tetraméricos. Uma abordagem alternativa é estudar interfaces individuais de um filamento (G e/ou NC) por separado. Assim, o presente projeto objetivou estudar, utilizando uma abordagem biofísica e estrutural, a interface G formada por SEPT5 e SEPT8 para elucidar os fatores importantes em determinar a sua especificidade. Os domínios GTPase de SEPT5 e SEPT8 foram clonadas em vetor de expressão bicistrônico pET-Duet, co-expressas e co-purificadas. Estudos de análise do estado oligomérico e homogeneidade foram conduzidos utilizando cromatografia de exclusão molecular, espalhamento dinâmico de luz e ultracentrifugação analítica, revelando um complexo dimérico e monodisperso. O complexo apresenta uma mistura aproximadamente equimolar de nucleotídeos (GTP e GDP) ligados enquanto SEPT8(G) sozinha é incapaz de ligar qualquer um dos dois. Além disto o complexo apresenta uma termoestabilidade maior que SEPT8(G), verificado por um aumento em Tm de 5°C. Com o intuito de observar os determinantes estruturais da especificidade, ensaios de cristalização foram conduzidos e assim, cristais do complexo SEPT5-SEPT8(G) que difrataram apenas a muito baixa resolução foram obtidos. Na ausência de uma estrutura cristalográfica, modelagem por homologia foi realizada para analisar as interfaces G entre diferentes combinações de septinas. Identificamos uma interação entre aminoácidos característicos (aminoácidos únicos para cada grupo de septinas) para o complexo formado entre membros do grupo III, (incluindo SEPT5) e membros do grupo II, (incluindo SEPT8). Esta interação entre Phe131 (grupo III) e Thr19 (grupo II) pode explicar a especificidade na formação de uma interface G entre septinas destes grupos durante a formação do filamento e além disso, a importância da presença do GTP ligado ao septina do grupo II. Com isto, propomos pela primeira vez uma explicação plausível da relevância da perda de atividade catalítica das septinas deste grupo, um fato inexplicado até o momento. Mutação dos resíduos identificados levou a uma mudança no seu perfil de eluição do complexo durante purificação por exclusão molecular indicando alterações na formação do complexo mutante. / Septins are a conserved family of proteins that bind and hydrolyze GTP and form heterofilaments, rings and networks in order to carry out their functions. They have three structural domains: an N-terminal domain containing a polybasic sequence (for membrane binding), a nucleotide-binding (G) domain and a C-terminal domain including a sequence predicted to form a coiled-coil. In humans, 13 septins have been classified into four groups (I, II, III and IV) based on their amino acid sequences. The only structurally characterized filament described to date is formed by SEPT2-SEPT6-SEPT7, which reveals that the subunits interact through two different interfaces (G and NC). The structural determinants of correct filament assembly are poorly known, and this is limited by the complexity of purifying and crystallizing trimeric or tetrameric complexes. An alternative approach is to study a single filament interface (G or NC) on its own. Here, we aimed to study, using biophysical and structural approaches, the G interface formed between SEPT5 and SEPT8 to elucidate the factors relevant to determining its specificity. The GTPase domain of SEPT5 and SEPT8, were cloned into the bicistronic expression vector pET-Duet, co-expressed and co-purified. Studies to determine the oligomeric state and homogeneity of the complex were conducted using size exclusion chromatography, dynamic light scattering and analytical ultracentrifugation, revealing a monodisperse dimer for SEPT5-SEPT8(G). The complex elutes with an approximately equimolar mixture of bound nucleotides (GTP and GDP) whereas SEPT8(G) alone is shown to be unable to bind either. Furthermore, the complex has a greater thermostability than SEPT8(G), demonstrated by an increase of 5°C in Tm. In order to determine the structural determinants of specificity, crystallization trials were conducted and crystals of the SEPT5-SEPT8(G) complex were obtained, but these diffracted to only very low resolution. In the absence of a crystal structure, homology modeling was performed to analyze the potential G interfaces between different septin combinations. An interaction between characteristic amino acids (those which are unique to given septin group) was identified for the complex formed between group III septins (including SEPT5) and group II septins (including SEPT8). This interaction, between Phe131 (group II) and Thr19 (group III) may explain the specificity in the formation of a G interface between septins of these groups during filament formation and furthermore the importance of GTP bound to the group II septin. These observations allow us to propose for the first time a plausible explanation for relevance of the loss of catalytic activity by this septin group, an unexplained fact up until now. Mutation of the identified residues resulted in a change in the elution profile of the complex from the size exclusion column suggesting structural alterations in the mutants.