Memoria para optar al título Profesional de Médico Veterinario / Las enfermedades causadas por los péptidos amiloides son numerosas y heterogéneas, afectan a una gran cantidad de órganos y son de importancia tanto para el hombre como los animales. A pesar de que una característica común que engloba este tipo de enfermedades radica en la observación macroscópica extracelular de placas amiloides, numerosos estudios han demostrado que el principal mecanismo de daño celular corresponde a la actividad citotóxica de los péptidos amiloides solubles más que a los depósitos insolubles de placas amiloides extracelulares. En la actualidad, la teoría más aceptada que explica este mecanismo de toxicidad corresponde a la formación de canales permeables a cationes generados por los péptidos amiloides solubles en las membranas de células susceptibles, produciéndose elevaciones masivas de calcio intracelular ([Ca2+]i). Sin embargo, los factores que determinan la susceptibilidad celular individual para este proceso no han sido completamente identificados. Este trabajo se basó en la hipótesis de que el stress metabólico incrementa la susceptibilidad celular frente a la toxicidad de los péptidos amiloides al alterar la composición fosfolipídica de la membrana. Con esta finalidad, células neuronales y endocrinas fueron sometidas a un stress metabólico determinado por la disminución en las concentraciones de glucosa en su medio de cultivo o por la aplicación de un bloqueador de la glicólisis (ácido 3 bromopirúvico), siendo evaluados posteriormente los cambios en la [Ca2+]i y la viabilidad celular. Los resultados obtenidos en astrocitos indicaron que aquellas células cultivadas en ausencia de glucosa son significativamente más susceptibles al efecto tóxico de los péptidos amiloides. Se observaron aumentos considerables en la [Ca2+]i pocos segundos después de la aplicación de amilina humana soluble, péptido de origen beta pancreático. No se observaron cambios en la [Ca2+]i en células cultivadas con glucosa. Estas observaciones sugieren la presencia de una interacción péptido-membrana. No se observaron disminuciones en la producción de ATP para células cultivadas en ausencia de glucosa. Los resultados obtenidos en las células beta pancreáticas demostraron que las células más susceptibles al efecto de los péptidos eran aquellas cultivadas en presencia del ácido 3 bromopirúvico, pero no aquellas cultivadas en ausencia de glucosa, determinado por un aumento en la mortalidad celular cuando las células en presencia del bloqueador metabólico fueron expuestas al péptido β amiloide, de origen neuronal. Se logró comprobar una disminución en la producción de ATP en células cultivadas en ausencia de glucosa versus aquellas cultivadas con altas concentraciones de glucosa. No se observó una asociación entre esta disminución en la producción de ATP con el aumento de la susceptibilidad a los péptidos amiloides. En conjunto, las observaciones permitieron concluir que el stress metabólico es efectivamente un importante factor que incrementa la susceptibilidad celular frente a los péptidos amiloides. No se observó que este efecto se debiera a una disminución en la producción de ATP, factor que induciría una falla en la actividad de las enzimas estabilizadoras de la membrana celular. Nosotros sugerimos que la activación de la cascada de la apoptosis explicaría de mejor manera los cambios en la composición de la membrana celular que la disminución de las concentraciones de ATP. Existen mecanismos celulares que regulan eficientemente la producción de energía y son muy sensibles frente a cambios en el estatus energético celular (sistema AMPK sensor de energía). Cuando el déficit de energía es muy prolongado y el sistema ya no es capaz de compensar las pérdidas, se activa la apoptosis, siendo unos de sus primeros efectos la alteración de la composición de la membrana celular. Esto sería en última instancia lo que incrementaría la susceptibilidad frente a los péptidos amiloides. Para futuras investigaciones, se sugiere profundizar en los mecanismos metabólicos específicos que afectarían la susceptibilidad celular frente a los péptidos amiloides, como también determinar los cambios específicos que se producen a nivel de las membranas celulares cuando las células se ven enfrentadas a desafíos metabólicos.

Made available in DSpace on 2016-07-13T19:05:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 mariana_cunha_ioc_dout_2015.pdf: 12334433 bytes, checksum: 5e288d54da3b70496ff176f2e68a6290 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Introdução: O CCR2 é o receptor do CCL2/MCP-1. O CCR2 é expresso em monócitos, células endoteliais, neutrófilos ativados, micróglia e astrócitos. Recentemente, alguns estudos mostram a expressão constitutiva do CCR2 e do CCL2 em regiões do sistema nervoso central, como o hipocampo. Como o hipocampo está envolvido com a consolidação de memória, nós analisamos o papel do CCR2 no processo de aprendizado e consolidação de memória. Métodos: Animais geneticamente deficientes para o CCR2 e animais controle foram submetidos a esquiva passiva e a natação forçada, para examinar a memória aversiva e a memória contextual. A resposta motora foi avaliada pelo ensaio de campo aberto, e o reflexo pelo teste de inibição de pré-pulso. Os animais foram submetidos a esquiva passiva de múltiplos treinos para analisar a curva de aprendizado e o esquecimento da memória. O próximo passo foi verificar a expressão de importantes mediadores envolvidos com a consolidação de memória por western blotting, como a ERK fosforilada e BDNF. E o ultimo passo foi verificar se a deficiência do CCR2 afeta a sinapse no hipocampo, pela expressão e co-localização de PSD95 e sinaptofisina por imunohistoquímica e a expressão de sinaptofisina e PSD95 por western blotting. Resultados: A ausência do CCR2, impediu a consolidação de memória aversiva e a memória contextual O animal deficiente para o CCR2 requer mais treinos para aprender na esquiva passiva e a memória decai de forma mais rápida, quando comparado com o grupo controle. A expressão de ERK fosforilada está reduzida 1 hora após um treino na esquiva passiva no hipocampo de animais deficientes para o CCR2 assim como a expressão de BDNF maduro está reduzida 12 horas após um treino na esquiva passiva. Nós observamos que a deficiência do CCR2 afeta a sinapse, com importante redução da co-localização entre sinaptofisina e PSD95 no hipocampo e redução na expressão de sinaptofisina no hipocampo. Os animais CCR2-/- tem aumento da expressão da proteina amilóide beta no hipocampo e no córtex cerebral ao redor dos vasos sanguíneos, associado com redução da perfusão sanguínea no cérebro, redução da expressão de caspases-3 e -12, sem diferença na expressão de IBA-1 e nos níveis de citocinas e quimiocinas no cérebro. Conclusão: A ausência do CCR2 altera a estrutura das sinapses, reduzindo a expressão da proteína pré-sináptica sinaptofisina e PSD95, bem como leva ao acúmulo de proteína amiloide beta no tecido cerebral, culminando com a disfunção cognitiva / Abstract: Background: CCR2 is the receptor for CCL2/MCP-1. CCR2 is expressed in monocytes, endothelial cells, activated neutrophils, microglial cells and astrocytes. Some studies show the constitutive expression of CCR2 and CCL2/MCP-1 in specific areas of the central nervous system, such as the hippocampus. Because the hippocampus is important for memory consolidation, we studied the role of CCR2 in learning process and in memory consolidation. Methods: CCR2 deficient mice and wild type were submitted to passive avoidance test and to water maze test, to evaluate aversive memory and contextual memory, respectively. The motor response was evaluated by open field test, while the reflex was evaluated by pre-pulse inhibitory response. The animals were submitted to passive avoidance test of multiple trials, to analyze the learning curve and the retrieval of memory. The next step was to verify the expression of proteins involved with memory consolidation, such as the phosphorylated ERK and mature BDNF by western blotting,. And the last step was to verify if the CCR2 deficiency affect the synapsis in hippocampus, by the expression and co-localization of PSD95 and synaptophysin using immunohistochemistry and the expression of synaptophysin and PSD95 by western blotting. Results: The absence of CCR2, impaired consolidation of aversive and contextual memories The CCR2 deficient mice required more trials to learn in passive avoidance test and the memory decay was faster, when compared to the wild type group. The expression of phosphorylated ERK is decreased 1 hour after one trial in passive avoidance test in the hippocampus of CCR2 deficient mice as was the expression of mature BDNF 12 hours after one trial in passive avoidance test. We observed that the deficiency of CCR2 affects the synapsis, with an important decrease in co-localization of PSD95 and synaptophysin in the hippocampus and decreased expression of synaptophysin in the hippocampus of CCR2 deficient mice. CCR2-/- animal had increased expression of beta amyloid protein around the blood vessels in the hippocampus and in the cortex, associated with decreased brain perfusion, increased expression of caspase-12 and caspase-3, but no difference in the expression of IBA-1 and in cytokines and chemokines levels. Conclusions: Absence of CCR2 changes the structure of synapsis, decreasing the pre-synaptic protein synaptophysin in hippocampus and also lead to accumulation of beta amyloid protein in brain tissue, culminating with cognitive dysfunction

Neste trabalho estudamos por espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) quatro diferentes sistemas de interesse biológico. Visamos investigar a auto-agregação de proteínas e de complexos proteicos que darão origem a fibras amilóides, interação proteína-proteína, simulando ambientes altamente concentrados, interação proteína-membrana simulando vesículas de matriz extracelular (MVs) de sistemas de biomineralização e interações proteína-agentes desnaturantes. No caso de formação de amilóides, investigamos a agregação do domínio GTPase da septina 6 (SEPT6G) e do complexo formado com o domínio GTPase da septina 2 (SEPT2G-SEPT6G). A temperaturas de até 15°C, tanto SEPT6G quanto SEPT2G-SEPT6G apresentam-se predominantemente diméricas em solução. Já a 25°C, o heterodímero SEPT2G-SEPT6G permanece estável enquanto agregados maiores de SEPT6G evoluem e coexistem em solução com SEPT6G-SEPT6G dimérica, sendo que a proporção de dímeros diminui com a temperatura. No estudo das MVs, mostramos que miméticos lipossomais de DPPC e DPPC:DPPS (9:1) possuem as mesmas características estruturais na ausência e presença de cálcio na solução. A interação da proteína anexina V humana (A5), envolvida em processos de biomineralização, impacta na membrana modelo induzindo a formação de nanoporos. A adição da fosfatase alcalina tecido não-específico (TNAP) não altera as propriedades estruturais do proteolipossomo na presença de A5. A ação do surfactante dodecil sulfato de sódio (SDS) a 30 mM não altera a conformação da albumina soro bovina (BSA), de maneira que é observada a formação de micelas de SDS coexistindo com a proteína livre em solução. Já a adição de 50 mM de SDS induz um desenovelamento parcial da proteína, identificado pela análise das curvas de SAXS via modelo de \"colar de pérolas\". A ação de uréia a 3 M e 8 M promove um desenovelamento parcial e total da BSA, respectivamente, com subsequente agregação de proteína dependente da temperatura (T > 30°C). A adição de 6 mM de SDS em proteínas parcialmente desenoveladas pela ação da uréia promove um desenovelamento mais acentuado. O potencial efetivo resultante da interação entre duas proteínas distintas, BSA e lisozima a concentração total de 100 mg/mL em solução, pH 7.0, foi obtido da análise de curvas de SAXS. Para isto, utilizou-se uma análise simplificada (em primeira aproximação) considerando um potencial efetivo de interação entre BSA-BSA, lisozima-lisozima e lisozima-BSA. Variamos a razão molar BSA:LISO até 1:42. No pH estudado, BSA tem uma carga residual superficial de -11e, enquanto a lisozima possui +9e. Conforme variamos a razão molar BSA:LISO, observamos dois regimes para o potencial efetivo resultante: i) até BSA:LISO 1:2, a carga efetiva do sistema é praticamente nula com um potencial resultante de caráter atrativo e ii) para razões entre BSA:LISO 1:3 a 1:42, a carga efetiva aumenta e o potencial resultante tem caráter repulsivo. Assim, lisozima e BSA coexistem sem agregar, através de um delicado balanço de forças atrativas e repulsivas no sistema. / In this work we have used small-angle x-ray scattering (SAXS) to study four systems of biological interest. We aim to investigate the self aggregation of proteins and protein complexes that would form amyloid fibers; protein/protein interaction, simulating high concentrations; protein/cell-membrane interaction, simulating extracellular matrix vesicles (MVs) from biomineralizing systems; and protein/denaturating-agents interactions. On the case of amyloid formation, we have investigated the aggregation of G-domain of septin-6 (SEPT6G) and the protein complex formed with G-domain of septin-2 (SEPT2G-SEPT6G). At temperatures lower than 15°C, both SEPT6G and SEPT2G-SEPT6G were found predominantly as dimers. At 25°C, SEPT2G-SEPT6G heterodimer is still stable while aggregates of SEPT6G grow. Both coexist in solutions of SEPT2G-SEPT6G dimers, with the percentage of dimers decreasing the higher the temperature. As for the study of MVs, we have shown that DPPC and DPPC:DPPS (9:1) liposomal mimetics have the same structural characteristics at the absence or presence of Calcium. The interaction with human annexin V protein (A5), related to biomineralization processes, affects the model membrane by the creation of nanopores. The addition of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) does not change the structural properties of the proteoliposome when A5 is present. The addition of SDS surfactant (30 mM) does not alters the conformation of bovine serum albumin (BSA), and we have observed the formation of SDS micelles coexisting with free protein in solution. The addition of 50 mM of SDS, on the other hand, induces the partial unraveling of the protein, as seen by the analysis of SAXS data via the pearl necklace\'\' model. The effect of adding 3M and 8M urea is, respectively, the partial and total unraveling of BSA, with ensuing aggregation of the protein dependent on the temperature (T > 30°C). The introduction of SDS 6mM promotes further unraveling in proteins that were previously partially unraveled by urea. The resulting effective potential for the interaction between BSA and lysozyme at total concentration of 100mg/ml and 7.0 pH has been obtained from the analysis of SAXS curves. In order to obtain this result we have used a simplified analysis (first order approximation) in which were considered the effective potentials for the interactions between BSA-BSA, lysozyme-lysozyme and lysozyme-BSA. We have varied the BSA:LISO molar ratio up to 1:42. At the studied pH, BSA has a surface residual charge of -11e, and lysozyme has +9e. As we changed the BSA:LISO molar ratio, we have found two regimens for the resulting effective potential: i) up to BSA:LISO 1:2, the effective charge of the system is virtually zero and the resulting potential is attractive; and ii) for BSA:LISO between 1:3 and 1:42 the effective charge increases, and the resulting potential is repulsive. Therefore, both lysozyme and BSA coexist without forming aggregates, by a delicate balance of attractive and repulsive forces.

A terapia de quelação tem sido descrita na literatura como uma ferramenta importante no combate de processos neurodegenerativos como a doença de Alzheimer (AD). Esta doença é caracterizada pela agregação de peptídeos β-amiloides, formando fibrilas, que parece ser induzida ou facilitada em presença de íons metálicos como Cu2+, Zn2+ ou Fe3+. Vários compostos já foram testados e descritos como ligantes competitivos para coordenar e retirar estes íons dos agregados proteicos em condições patológicas, na chamada hipótese da cascata amiloide. O presente projeto visou investigar a reatividade de ligantes imínicos, derivados de oxindóis, na quelação de cobre(II) e zinco(II), numa tentativa de inibir ou evitar a formação de agregados relacionados à AD. Foram sintetizados seis compostos imínicos, sendo duas hidrazonas inéditas: isahim e isahpy e quatro bases de Schiff: isapn, misapn, isaen e misaen, as três últimas também inéditas. Os compostos foram caracterizados por espectroscopia FTIR, RMN, UV/VIS e por análise elementar CHN e espectrometria de massas ESI-MS/MS. Os valores das constantes de estabilidade (log β 2,7 - 5,1) para a formação dos complexos [ML]2+ e do aduto [(Aβ1-16)2•isahim] em solução aquosa foram determinadas por espectroscopia UV/VIS. As formas de interação dos compostos isapn, misapn e isahim com o peptídeo Aβ1-16 foram analisadas por espectroscopia 1H RMN, observando-se uma forte interação com as histidinas His6, His13 e His14 e com os carboxilatos do peptídeo. A eficácia dos ligantes foi testada frente ao processo de inibição da agregação do peptídeo Aβ1-40 na presença e ausência de íons Cu2+ ou Zn2+ por turbidimetria. Estudos de docking e dinâmica molecular suportam que a interação dos ligantes imínicos com o peptídeo Aβ1-16 ocorre nos mesmos sítios de coordenação dos íons metálicos. Os resultados indicam que os compostos aqui estudados podem atuar como eficientes inibidores de agregação dos peptídeos amiloides implicados na AD. / Chelation therapy has been considered in the literature an important tool in neurodegenerative processes like Alzheimer disease (AD). This disease is characterized by aggregation of β-amyloid peptides that seems to be improved in the presence of metal ions, particularly copper, zinc and iron. Several compounds have been tested and reported as competitive ligands to withdrawal these metal ions from protein aggregates in pathologic conditions, in the \"amyloid cascade hypothesis\". The present project aims to investigate the reactivity of imine ligands, particularly those derived from oxindoles, in the chelation of copper(II) and zinc(II) ions trying to inhibit or avoid aggregate formation related to AD. Six iminic compounds were synthesized, being two of them hydrazones: isahim and isahpy and four Schiff bases: isapn, misapn, isaen, and misaen. The compounds were characterized by spectroscopic analysis (FTIR, NMR, UV/VIS), elemental analysis CHN and mass spectrometry ESI-MS/MS. The corresponding stability constants (log β 2,7-5,1) for each complex formation [ML]2+ as well as for the adduct [(Aβ1-16)2•isahim] in aqueous solution were determined by UV/VIS spectroscopy. Interactions of compounds isapn, misapn and isahim with the Aβ1-16 peptide were detected and analyzed by 1H NMR spectroscopy, indicating a strong interaction among the compounds and the histidines His6, His13 e His14 as well as the carboxylate residues in the peptides. The ligands efficiency toward the inhibition aggregation process for the Aβ1-40 peptide were evaluated in the presence, and in absence of Cu2+ or Zn2+ ions by turbidimetry. Computational calculations (docking and molecular dynamics) indicated that the interaction of the imine ligand with the Aβ1-16 peptide occurs in the metal coordination sites. The results indicate that these imine compounds studied may act as efficient inhibitors of amyloid peptides implicated in AD.

A terapia de quelação tem sido descrita na literatura como uma ferramenta importante no combate de processos neurodegenerativos como a doença de Alzheimer (AD). Esta doença é caracterizada pela agregação de peptídeos β-amiloides, formando fibrilas, que parece ser induzida ou facilitada em presença de íons metálicos como Cu2+, Zn2+ ou Fe3+. Vários compostos já foram testados e descritos como ligantes competitivos para coordenar e retirar estes íons dos agregados proteicos em condições patológicas, na chamada hipótese da cascata amiloide. O presente projeto visou investigar a reatividade de ligantes imínicos, derivados de oxindóis, na quelação de cobre(II) e zinco(II), numa tentativa de inibir ou evitar a formação de agregados relacionados à AD. Foram sintetizados seis compostos imínicos, sendo duas hidrazonas inéditas: isahim e isahpy e quatro bases de Schiff: isapn, misapn, isaen e misaen, as três últimas também inéditas. Os compostos foram caracterizados por espectroscopia FTIR, RMN, UV/VIS e por análise elementar CHN e espectrometria de massas ESI-MS/MS. Os valores das constantes de estabilidade (log β 2,7 - 5,1) para a formação dos complexos [ML]2+ e do aduto [(Aβ1-16)2•isahim] em solução aquosa foram determinadas por espectroscopia UV/VIS. As formas de interação dos compostos isapn, misapn e isahim com o peptídeo Aβ1-16 foram analisadas por espectroscopia 1H RMN, observando-se uma forte interação com as histidinas His6, His13 e His14 e com os carboxilatos do peptídeo. A eficácia dos ligantes foi testada frente ao processo de inibição da agregação do peptídeo Aβ1-40 na presença e ausência de íons Cu2+ ou Zn2+ por turbidimetria. Estudos de docking e dinâmica molecular suportam que a interação dos ligantes imínicos com o peptídeo Aβ1-16 ocorre nos mesmos sítios de coordenação dos íons metálicos. Os resultados indicam que os compostos aqui estudados podem atuar como eficientes inibidores de agregação dos peptídeos amiloides implicados na AD. / Chelation therapy has been considered in the literature an important tool in neurodegenerative processes like Alzheimer disease (AD). This disease is characterized by aggregation of β-amyloid peptides that seems to be improved in the presence of metal ions, particularly copper, zinc and iron. Several compounds have been tested and reported as competitive ligands to withdrawal these metal ions from protein aggregates in pathologic conditions, in the \"amyloid cascade hypothesis\". The present project aims to investigate the reactivity of imine ligands, particularly those derived from oxindoles, in the chelation of copper(II) and zinc(II) ions trying to inhibit or avoid aggregate formation related to AD. Six iminic compounds were synthesized, being two of them hydrazones: isahim and isahpy and four Schiff bases: isapn, misapn, isaen, and misaen. The compounds were characterized by spectroscopic analysis (FTIR, NMR, UV/VIS), elemental analysis CHN and mass spectrometry ESI-MS/MS. The corresponding stability constants (log β 2,7-5,1) for each complex formation [ML]2+ as well as for the adduct [(Aβ1-16)2•isahim] in aqueous solution were determined by UV/VIS spectroscopy. Interactions of compounds isapn, misapn and isahim with the Aβ1-16 peptide were detected and analyzed by 1H NMR spectroscopy, indicating a strong interaction among the compounds and the histidines His6, His13 e His14 as well as the carboxylate residues in the peptides. The ligands efficiency toward the inhibition aggregation process for the Aβ1-40 peptide were evaluated in the presence, and in absence of Cu2+ or Zn2+ ions by turbidimetry. Computational calculations (docking and molecular dynamics) indicated that the interaction of the imine ligand with the Aβ1-16 peptide occurs in the metal coordination sites. The results indicate that these imine compounds studied may act as efficient inhibitors of amyloid peptides implicated in AD.

Neste trabalho estudamos por espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) quatro diferentes sistemas de interesse biológico. Visamos investigar a auto-agregação de proteínas e de complexos proteicos que darão origem a fibras amilóides, interação proteína-proteína, simulando ambientes altamente concentrados, interação proteína-membrana simulando vesículas de matriz extracelular (MVs) de sistemas de biomineralização e interações proteína-agentes desnaturantes. No caso de formação de amilóides, investigamos a agregação do domínio GTPase da septina 6 (SEPT6G) e do complexo formado com o domínio GTPase da septina 2 (SEPT2G-SEPT6G). A temperaturas de até 15°C, tanto SEPT6G quanto SEPT2G-SEPT6G apresentam-se predominantemente diméricas em solução. Já a 25°C, o heterodímero SEPT2G-SEPT6G permanece estável enquanto agregados maiores de SEPT6G evoluem e coexistem em solução com SEPT6G-SEPT6G dimérica, sendo que a proporção de dímeros diminui com a temperatura. No estudo das MVs, mostramos que miméticos lipossomais de DPPC e DPPC:DPPS (9:1) possuem as mesmas características estruturais na ausência e presença de cálcio na solução. A interação da proteína anexina V humana (A5), envolvida em processos de biomineralização, impacta na membrana modelo induzindo a formação de nanoporos. A adição da fosfatase alcalina tecido não-específico (TNAP) não altera as propriedades estruturais do proteolipossomo na presença de A5. A ação do surfactante dodecil sulfato de sódio (SDS) a 30 mM não altera a conformação da albumina soro bovina (BSA), de maneira que é observada a formação de micelas de SDS coexistindo com a proteína livre em solução. Já a adição de 50 mM de SDS induz um desenovelamento parcial da proteína, identificado pela análise das curvas de SAXS via modelo de \"colar de pérolas\". A ação de uréia a 3 M e 8 M promove um desenovelamento parcial e total da BSA, respectivamente, com subsequente agregação de proteína dependente da temperatura (T > 30°C). A adição de 6 mM de SDS em proteínas parcialmente desenoveladas pela ação da uréia promove um desenovelamento mais acentuado. O potencial efetivo resultante da interação entre duas proteínas distintas, BSA e lisozima a concentração total de 100 mg/mL em solução, pH 7.0, foi obtido da análise de curvas de SAXS. Para isto, utilizou-se uma análise simplificada (em primeira aproximação) considerando um potencial efetivo de interação entre BSA-BSA, lisozima-lisozima e lisozima-BSA. Variamos a razão molar BSA:LISO até 1:42. No pH estudado, BSA tem uma carga residual superficial de -11e, enquanto a lisozima possui +9e. Conforme variamos a razão molar BSA:LISO, observamos dois regimes para o potencial efetivo resultante: i) até BSA:LISO 1:2, a carga efetiva do sistema é praticamente nula com um potencial resultante de caráter atrativo e ii) para razões entre BSA:LISO 1:3 a 1:42, a carga efetiva aumenta e o potencial resultante tem caráter repulsivo. Assim, lisozima e BSA coexistem sem agregar, através de um delicado balanço de forças atrativas e repulsivas no sistema. / In this work we have used small-angle x-ray scattering (SAXS) to study four systems of biological interest. We aim to investigate the self aggregation of proteins and protein complexes that would form amyloid fibers; protein/protein interaction, simulating high concentrations; protein/cell-membrane interaction, simulating extracellular matrix vesicles (MVs) from biomineralizing systems; and protein/denaturating-agents interactions. On the case of amyloid formation, we have investigated the aggregation of G-domain of septin-6 (SEPT6G) and the protein complex formed with G-domain of septin-2 (SEPT2G-SEPT6G). At temperatures lower than 15°C, both SEPT6G and SEPT2G-SEPT6G were found predominantly as dimers. At 25°C, SEPT2G-SEPT6G heterodimer is still stable while aggregates of SEPT6G grow. Both coexist in solutions of SEPT2G-SEPT6G dimers, with the percentage of dimers decreasing the higher the temperature. As for the study of MVs, we have shown that DPPC and DPPC:DPPS (9:1) liposomal mimetics have the same structural characteristics at the absence or presence of Calcium. The interaction with human annexin V protein (A5), related to biomineralization processes, affects the model membrane by the creation of nanopores. The addition of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) does not change the structural properties of the proteoliposome when A5 is present. The addition of SDS surfactant (30 mM) does not alters the conformation of bovine serum albumin (BSA), and we have observed the formation of SDS micelles coexisting with free protein in solution. The addition of 50 mM of SDS, on the other hand, induces the partial unraveling of the protein, as seen by the analysis of SAXS data via the pearl necklace\'\' model. The effect of adding 3M and 8M urea is, respectively, the partial and total unraveling of BSA, with ensuing aggregation of the protein dependent on the temperature (T > 30°C). The introduction of SDS 6mM promotes further unraveling in proteins that were previously partially unraveled by urea. The resulting effective potential for the interaction between BSA and lysozyme at total concentration of 100mg/ml and 7.0 pH has been obtained from the analysis of SAXS curves. In order to obtain this result we have used a simplified analysis (first order approximation) in which were considered the effective potentials for the interactions between BSA-BSA, lysozyme-lysozyme and lysozyme-BSA. We have varied the BSA:LISO molar ratio up to 1:42. At the studied pH, BSA has a surface residual charge of -11e, and lysozyme has +9e. As we changed the BSA:LISO molar ratio, we have found two regimens for the resulting effective potential: i) up to BSA:LISO 1:2, the effective charge of the system is virtually zero and the resulting potential is attractive; and ii) for BSA:LISO between 1:3 and 1:42 the effective charge increases, and the resulting potential is repulsive. Therefore, both lysozyme and BSA coexist without forming aggregates, by a delicate balance of attractive and repulsive forces.

O acelerado processo de envelhecimento tem trazido não só mudanças no perfil demográfico, mas também no perfil epidemiológico da população. Entre os problemas de saúde encontrados em idosos, merecem destaque os transtornos mentais, visto que acometem cerca de um terço dessa população, sendo os transtornos depressivos e a demência os problemas de saúde mental mais prevalentes. O transtorno depressivo maior (TDM), bem como o comprometimento cognitivo leve (CCL), tem sido associado prejuízo das funções cognitivas, além de aumentar o risco de desenvolvimento de demência, principalmente doença de Alzheimer (DA). Sendo assim, é importante que haja identificação preventiva de pessoas com maior risco para o desenvolvimento de DA a fim de proporcionar um tratamento precoce. Dessa maneira este estudo objetivou comparar os marcadores biológicos envolvidos na cascata amiloide, expressos em leucócitos e líquor, nas condições clínicas TDM, CCL, DA e controles saudáveis. Para tanto, foi determinada a expressão proteica das secretases ADAM10, BACE1 e PSEN1 e do peptídeo A? em leucócitos e líquor pelos métodos de Western Blotting, ELISA e Luminex. Ao analisarmos a expressão das secretases e do peptídeo Abeta em leucócitos não observamos diferenças estatisticamente significantes entre os grupos, exceto pela expressão da proteína PSEN1, que apresentou menores níveis em DA em relação à TDM. Em relação ao líquor, observamos uma significativa diminuição do peptídeo A? no grupo DA quando comparado aos grupos CCL, TDM e também a controles saudáveis; porém não foram observadas diferenças de expressão desse peptídeo entre CCL, TDM e controles saudáveis. Esses resultados sugerem que a matriz leucocitária, apesar de expressar os componentes desta via, sugerindo dispor da maquinaria enzimática necessária para o processamento da proteína precursora do amiloide (APP), não é a ideal para estudos sobre a cascata amiloide. Além disso, os resultados obtidos em amostras de líquor, de acordo com a casuística analisada, reforçam os dados da literatura que estabelecem a redução da concentração do peptídio Abeta no líquor como um biomarcador da DA, sem termos detectado alterações nos demais grupos estudados. Nossos resultados (negativos) em relação à expressão das APP-secretases no líquor acrescentam dados a este domínio ainda controverso da literatura. Assim sendo, mais estudos devem ser realizados para que possamos compreender melhor as vias relacionadas ao desenvolvimento da DA / The accelerated aging process has brought not only changes in the demographic profile, but also in the epidemiological profile of the population. Among the health problems found in the elderly, mental disorders are worth mentioning, since they affect about a third of this population, being the depressive disorders and dementia the most prevalent mental health problems. Major depressive disorder (MDD), as well as mild cognitive impairment (MCI), have been associated with higher levels of cognitive symptoms and increased risk of developing dementia, especially Alzheimer\'s disease (AD). Therefore, it is important to identify individuals at greater risk for the development of AD in order to provide treatment at early stages of the disease process. In this way, this study aimed to compare the biological markers involved in the amyloid cascade under the clinical conditions TDM, CCL, DA and healthy controls expressed in leukocytes and CSF. We determined the protein expression of ADAM10, BACE1 and PSEN1 and A? peptides in leucocytes and CSF using the Western Blotting, ELISA and Luminex methods. When analyzing the expression of the secretases and the A? peptide in leukocytes, we did not observe statistically significant differences between the groups, except for the expression of the PSEN1 protein, which presented lower levels in AD in relation to MDD. In relation to CSF, we observed a significant reduction of the Abeta peptide in AD when compared to MCI, TDM and also to healthy controls, but no differences in expression of this peptide were observed between MCI, MDD and healthy controls. These results suggest that the leukocytes, although expressing the key components and the enzymatic machinery necessary for the proteolytic processing of the amyloid precursor protein (APP), may not represent an adequate biological matrix for studies addessing the amyloid cascade. In addition, results obtained in CSF samples, according to the analyzed series, reinforce the literature data that establish the reduction of A? peptide concentration in CSF as a biomarker of AD, without detecting alterations in the other groups studied. Our (negative) results in relation to the expression of APP-secretases in CDescriptors: MSF add data to this still controversial domain of the literature. Therefore, more studies should be done so that we can better understand the pathways related to the development of AD

O acelerado processo de envelhecimento tem trazido não só mudanças no perfil demográfico, mas também no perfil epidemiológico da população. Entre os problemas de saúde encontrados em idosos, merecem destaque os transtornos mentais, visto que acometem cerca de um terço dessa população, sendo os transtornos depressivos e a demência os problemas de saúde mental mais prevalentes. O transtorno depressivo maior (TDM), bem como o comprometimento cognitivo leve (CCL), tem sido associado prejuízo das funções cognitivas, além de aumentar o risco de desenvolvimento de demência, principalmente doença de Alzheimer (DA). Sendo assim, é importante que haja identificação preventiva de pessoas com maior risco para o desenvolvimento de DA a fim de proporcionar um tratamento precoce. Dessa maneira este estudo objetivou comparar os marcadores biológicos envolvidos na cascata amiloide, expressos em leucócitos e líquor, nas condições clínicas TDM, CCL, DA e controles saudáveis. Para tanto, foi determinada a expressão proteica das secretases ADAM10, BACE1 e PSEN1 e do peptídeo A? em leucócitos e líquor pelos métodos de Western Blotting, ELISA e Luminex. Ao analisarmos a expressão das secretases e do peptídeo Abeta em leucócitos não observamos diferenças estatisticamente significantes entre os grupos, exceto pela expressão da proteína PSEN1, que apresentou menores níveis em DA em relação à TDM. Em relação ao líquor, observamos uma significativa diminuição do peptídeo A? no grupo DA quando comparado aos grupos CCL, TDM e também a controles saudáveis; porém não foram observadas diferenças de expressão desse peptídeo entre CCL, TDM e controles saudáveis. Esses resultados sugerem que a matriz leucocitária, apesar de expressar os componentes desta via, sugerindo dispor da maquinaria enzimática necessária para o processamento da proteína precursora do amiloide (APP), não é a ideal para estudos sobre a cascata amiloide. Além disso, os resultados obtidos em amostras de líquor, de acordo com a casuística analisada, reforçam os dados da literatura que estabelecem a redução da concentração do peptídio Abeta no líquor como um biomarcador da DA, sem termos detectado alterações nos demais grupos estudados. Nossos resultados (negativos) em relação à expressão das APP-secretases no líquor acrescentam dados a este domínio ainda controverso da literatura. Assim sendo, mais estudos devem ser realizados para que possamos compreender melhor as vias relacionadas ao desenvolvimento da DA / The accelerated aging process has brought not only changes in the demographic profile, but also in the epidemiological profile of the population. Among the health problems found in the elderly, mental disorders are worth mentioning, since they affect about a third of this population, being the depressive disorders and dementia the most prevalent mental health problems. Major depressive disorder (MDD), as well as mild cognitive impairment (MCI), have been associated with higher levels of cognitive symptoms and increased risk of developing dementia, especially Alzheimer\'s disease (AD). Therefore, it is important to identify individuals at greater risk for the development of AD in order to provide treatment at early stages of the disease process. In this way, this study aimed to compare the biological markers involved in the amyloid cascade under the clinical conditions TDM, CCL, DA and healthy controls expressed in leukocytes and CSF. We determined the protein expression of ADAM10, BACE1 and PSEN1 and A? peptides in leucocytes and CSF using the Western Blotting, ELISA and Luminex methods. When analyzing the expression of the secretases and the A? peptide in leukocytes, we did not observe statistically significant differences between the groups, except for the expression of the PSEN1 protein, which presented lower levels in AD in relation to MDD. In relation to CSF, we observed a significant reduction of the Abeta peptide in AD when compared to MCI, TDM and also to healthy controls, but no differences in expression of this peptide were observed between MCI, MDD and healthy controls. These results suggest that the leukocytes, although expressing the key components and the enzymatic machinery necessary for the proteolytic processing of the amyloid precursor protein (APP), may not represent an adequate biological matrix for studies addessing the amyloid cascade. In addition, results obtained in CSF samples, according to the analyzed series, reinforce the literature data that establish the reduction of A? peptide concentration in CSF as a biomarker of AD, without detecting alterations in the other groups studied. Our (negative) results in relation to the expression of APP-secretases in CDescriptors: MSF add data to this still controversial domain of the literature. Therefore, more studies should be done so that we can better understand the pathways related to the development of AD

[pt] A doença de Alzheimer (DA) é atualmente a forma mais comum de demência. A perda sináptica no nível do sistema neurotransmissor, a presença de placas amilóides extracelulares e emaranhados neurofibrilares intracelulares são importantes eventos que diferenciam, no nível celular, a DA dentre outras demências. Do ponto de vista químico, é bem conhecido que o peptídeo A(beta) coordena os metais fisiológicos, como Cu e Zn, os quais, no cérebro de pacientes com DA, estão mal distribuídos e concentrados em placas amilóides. Apesar da agregação do peptídeo A(beta) ser uma das características mais marcantes da patogênese da DA, a função das placas extracelulares composta por esse peptídeo não é totalmente compreendida. A hipótese que a neurotoxicidade de A(beta) é melhor explicada pela sua forma oligomérica é bastante aceita pela comunidade cientifica. Há evidências que suportam a ligação entre metais fisiológicos e oligomerização de A(beta). Os compostos atenuadores de interação metal-proteína (MPACs, do inglês, Metal-Protein Attenuating Compounds) são uma classe promissora de compostos para o tratamento da DA que diferem dos agentes quelantes fortes, porque, ao invés de remover metais sistematicamente, esses corrigem interações anormais com A(beta), inibindo a oligomerização de A(beta), além de prevenir reações redox que podem gerar espécies reativas de oxigenio tóxicas. Neste contexto, o presente trabalho avalia quatro compostos com potencial para atuar como MPAC, a saber, INHHQ, HPCIH, H2QBS e INHOVA. Entre esses, três (INHHQ, HPCIH e INHOVA) pertencem à classe química de aroíl-hidrazonas. A estabilidade de cada composto foi testada durante 30 h em misturas de água/DMSO em diferentes concentrações, a fim de definir a melhor condição para os estudos biológicos, e um padrão de estabilidade adequado foi observado para todos os compostos, com exceção do INHOVA, que se demonstrou muito sensível à hidrólise. INHHQ, HPCIH e H2QBS foram analisados in vitro para avaliar a capacidades de competir com A(beta) para Cu e Zn, por análises de RMN (1)H e (1)H x (15)N HSQC: INHHQ e HPCIH apresentaram perfis de sequestro de metais similares e H2QBS mostrou uma maior capacidade para a remoção de íons metálicos do A(beta). Estudos celulares foram realizados a fim de avaliar a citotoxicidade. INHHQ e HPCIH apresentaram os perfis mais promissores, sugerindo que tais toxicidades sejam relacionadas à sobre-expressão da proteína precursora amiloide (APP, do inglês: Amyloid precursor protein). Ambas as substâncias foram avaliadas quanto a sua capacidade de afetar a rota do APP por meio de análises proteômicas em uma linha celular que sobre-expressa APP. Os resultados sugeriram a possível interação dos compostos com as gama-secretases. Foram realizados ensaios de toxicidade aguda in vivo, não apresentando letalidade em doses de até 200 mg kg(-1) . Foram avaliados parâmetros bioquímicos, tais como as concentrações de GSH e Fe, Cu e Zn em cérebro, fígado, coração e rins. Os resultados sugeriram que H2QBS possui alta capacidade para deslocar os biometais em ratos, quando administrado em doses elevadas. Estudos de efetividade in vivo foram realizados para avaliar a capacidade da substância mais promissora, ou seja, INHHQ, de afetar o comportamento em modelos animais. Para esse propósito, ansiedade e memória foram avaliadas em camundongos, através dos testes de Labirinto em Cruz Elevado, Campo Aberto e Reconhecimento de Novo Objeto. Os resultados indicaram que o tratamento com INHHQ não altera a resposta defensiva relacionada ao medo/ansiedade e que doses de 10 mg kg(-1) ou maiores induzem comprometimento cognitivo temporário em camundongos saudáveis. Finalmente, provou-se que uma dosagem INHHQ inócua de 1 mg kg(-1) evita problemas de memória a curto e longo prazos induzidos pela infusão de oligômeros de Aβ em camundongos. Os resultados relatados nesta tese apontam para o INHHQ como um bom candidato p / [en] Alzheimer s disease (AD) is currently the most common form of dementia worldwide. The synaptic loss at the neurotransmitter system level and the presence of extracellular amyloid plaques and intracellular neurofibrillary tangles are major events that identify AD among other dementias, at the cellular level. From a chemical point of view, it is well-known that A(beta) peptide coordinates physiological metals, such as Cu and Zn, which, in AD patients brain, are poorly distributed and concentrated in amyloid plaques. Despite the fact that aggregation of the A(beta) peptide is one of the most important features of AD pathogenesis, the function of the extracellular plaques composed by this peptide is not fully understood. The hypothesis that A(beta) neurotoxicity is best explained by its oligomeric form is well accepted. There are evidences supporting the link between physiological metals and oligomerization of A(beta). Metal-Protein Attenuating Compounds (MPACs), a promising class of compounds for the management of AD and differ from strong chelating agents, once, instead of systematically removing metals, they correct abnormal interactions with A(beta), inhibiting the A(beta) oligomerization, as well as preventing redox reactions that can ultimately generate harmful reactive oxygen species (ROS). In this context, the present work evaluates four compounds with potential to act as MPACs, namely, INHHQ, HPCIH, H2QBS and INHOVA. Among them, three substances (INHHQ, HPCIH and INHOVA) belong to the chemical class of aroylhydrazones. The stability of each compound was tested over 30 h in water/DMSO mixtures of different concentrations in order to define the best condition for the biological studies and a suitable stability pattern was observed for all compounds, with the exception of INHOVA, which showed high sensibility to hydrolysis. INHHQ, HPCIH and H2QBS were analyzed in vitro in order to evaluate their ability to compete with A(beta) for Cu and Zn, by (1)H and (1)H x (15)N HSQC NMR analyses: a similar metalsequestering profile for INHHQ and HPCIH was observed, H2QBS, on the other hand, showed a higher capacity for the removal of metal ions from A(beta). Cell studies were performed in order to assess cytotoxicity. INHHQ and HPCIH showed the most promising profiles, suggesting that their toxicity was related to the amyloid precursor protein (APP) overexpression. Both substances were then evaluated concerning their capacity to affect the APP pathway by means of proteomic analyses in an exposed APP-overexpressing cell line. Results suggest possible interaction of both compounds with γ-secretases. In vivo acute toxicity assays were performed, showing no lethality at doses up to 200 mg kg(-1). Several biochemical parameters, such as GSH and Fe, Cu and Zn concentrations in brain, liver, heart and kidneys were evaluated. The results suggested that H2QBS present high capacity to displace biometals in rats, when high doses are administered. In vivo effectiveness studies were performed in order to evaluate the capacity of the most promising substance, i.e., INHHQ, of affecting behavior in animal models. For this purpose, anxiety and memory were evaluated in mice, through Elevated Plus Maze, Open Field and Novel Object Recognition tests. The results indicated that INHHQ treatment does not alter the fear / anxiety-related defensive responses and that doses of 10 mg kg(-1) or higher induce temporary cognitive impairment in healthy mice. Finally, it was proved that an innocuous INHHQ dosage of 1 mg kg (-1) does prevent short- and long-term memory impairment induced by A(beta) oligomers infusion in mice. The findings reported in this thesis definitively point to INHHQ as a good candidate for further pre-clinical trials, as a potential MPAC for AD treatment.

A neurodegeneração é um processo onde ocorre morte celular progressiva. O tráfego neuronal anterógrado e retrógado, e entre os compartimentos é essencial para a viabilidade celular. As proteínas Rabs pertencem à família de pequenas GTPases, com funções de tráfego de vesículas e organelas, para realizarem sua função as proteínas Rab podem recrutar proteínas motoras como as KIF 1B e KIF 5, responsáveis pelo transporte anterógrado mitocondrial. A associação do distúrbio do tráfego intracelular com doenças neurodegenerativas tem sido tema de estudos recentes. Com isso o objetivo do presente trabalho é analisar a expressão das proteínas Rab, bem como estudar as proteínas motoras que podem contribuir para o esclarecimento sobre os distúrbios no tráfego intracelular que antecedem a formação de agregados proteicos envolvidos em neurodegeneração. Para tanto, utilizou-se o modelo de tratamento com rotenona para indução de agregados em Ratos Lewis idosos que foram expostos a rotenona durante 4 semanas, em seguida foram avaliados os níveis de expressão das proteínas Rab no hipocampo, substância negra e locus coeruleus, por western blotting. Foram analisados também os níveis de expressão das proteínas motoras KIF1B e KIF5 antes e durante a formação de agregados proteicos, em culturas de células, de ratos Lewis neonatos, do hipocampo, substância negra e locus coeruleus tratadas com rotenona por 24 horas ou 48 horas nas concentrações de 0,1nM, 0, 3nM e 0,5nM. Foi observado diminuição dos níveis de expressão das proteínas Rab 1 nas regiões do hipocampo e locus coeruleus. Houve aumento de expressão das Rab 4,5 e 6 no hipocampo, porém na substância negra a expressão da Rab 1 aumentou e da Rab 6 diminuiu. Já no locus coeruleus in vivo a Rab 6 aumentou, mas as Rab 1, 5 e 11 diminuíram sua expressão. Já a expressão da KIF 5 aumentou com o tratamento de 0,1nM de rotenona e diminuiu após 0,5nM do xenobiótico por 48 horas in vitro, na mesma região. Na substância negra aumentaram as KIFs 1B e 5 após o tratamento com 0,5nM por 48 horas in vitro, mas diminuíram as KIF 1B e 5 após o tratamento com 0,3nM por 24 horas e KIF 5 após o tratamento com 0,1nM por 48 horas. Esses resultados permitem concluir que a expressão de proteínas importantes para o tráfego mitocondrial e de vesículas encontram-se alteradas e fazem parte dos eventos intracelulares que antecedem a neurodegeneração / Neurodegeneration is a process that leads to progressive cell death. The anterograde and retrograde neuronal traffic as well as the traffic between compartments are essential for cell viability. The Rab proteins belong to the small GTPases family with function of vesicles and organelle trafficking. Rab proteins can recruit motor proteins such as KIF 1B and KIF 5 that are responsible for anterograde mitochondrial transport. The association of intracellular traffic disturb with neurodegenerative diseases have been theme of recent studies. Thereat the objective of this study is analyze the expression of Rab and motor proteins that can contribute for the understanding about the disturb of the intracellular traffic that precedes protein aggregation involved in neurodegeneration. For this purpose it was employed the model of rotenone treatment for induction of aggregation in aged Lewis rats that were exposed to rotenone during 4 weeks in order to evaluate Rabs expression. The levels of motor proteins KIF 1B and KIF 5 expression were evaluated before and during the formation of protein aggregates in hippocampus, substantia nigra and locus coeruleus cell cultures of neonates Lewis rats, exposed to rotenone for 24 hours or 48 hours in the concentrations of 0.1nM, 0.3nM or 0.5nM. It was observed decreased levels of Rab 1 expression in hippocampus and locus coeruleus. Rabs 4,5 and 6 were increased in the hippocampus, but in the substantia nigra the expression of Rab 1 increased and Rab 6 decreased. In the locus coeruleus the Rab 6 increased, but Rabs 1, 5 and 11 decreased. The expression of KIF 5 increased after 0.1nM of rotenone and decreased after the exposure to 0.5nM of for 48 hours in cultured cell from the locus coeruleus. In the substantia nigra the KIF1B and KIF 5 increased after treatment with 0.5nM for 48 hours in vitro, but these protein decreased after treatment with 0.3nM for 24 hours in vitro, and KIF 5 after treatment with 0.1nM for 48 hours. These results allow us conclude that the expression of important proteins for the mitochondrial and vesicles traffic are altered and participate of intracellular events that precede the neurodegeneration