Made available in DSpace on 2015-12-06T23:44:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Fundo de Auxílio aos Docentes e Alunos (FADA) / Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (Pronex) / Objetivos: A nestina, uma proteína do filamento intermediário, pode ser usada como um indicador de imaturidade celular. Nas células já diferenciadas, essa proteína é substituída por outro tipo de filamento intermediário, específico do referido tecido. Porém, sua reexpressão pode ser induzida em condições regenerativas e/ou degenerativas. Assim, na tentativa de elucidar as alterações plásticas após um dano cerebral provocado pelo status epilepticus (SE) induzido pela pilocarpina em ratos, nossos objetivos foram: Ia) Estudar a expressão fisiológica normal da nestina no hipocampo e no córtex de ratos normais desde PN9 até a fase adulta (PN90); Ib) Avaliar as alterações da expressão da nestina no hipocampo e no córtex de ratos submetidos a três episódios de SE, induzidos pela pilocarpina, em PN7 PN8 e PN9. Esses animais foram estudados desde PN9 até PN90; 11) Estudar a expressão temporal e espacial da nestina no hipocampo de ratos adultos submetidos ao modelo da pilocarpina (fases aguda, silenciosa e crônica); 111) Avaliar a expressão da nestina no hipocampo de ratos idosos normais e em ratos idosos com epilepsia. Esses animais foram submetidos ao modelo da pilocarpina na fase adulta e seus cérebros foram estudados ao completarem dois anos de idade. Métodos: Indução do SE pela injeção de pilocarpina (ip); a expressão da nestina foi estudada por imuno-histoquímica. Resultados: No período pós-natal precoce, a expressão fisiológica da nestina foi intensamente visualizada nas glias radiais corticais, nas fibras hipocampais e nos vasos sanguíneos, desaparecendo nos animais adultos. Os animais submetidos ao SE em PN7-9, apresentaram aumento na expressão e atraso no desaparecimento da nestina, tanto nas glias radiais como nos vasos sanguíneos, em relação aos seus respectivos controles. Glias radiais corticais foram ainda encontradas nos ratos experimentais em PN21, enquanto que durante o desenvolvimento fisiológico normal elas já não estão mais presentes nessa idade. Quanto à distribuição temporal e espacial da nestina nos astrócitos reativos hipocampais de ratos adultos, submetidos ao modelo da pilocarpina, não encontramos a expressão dessa proteína nos animais dos grupos controle e agudo. Em contraste, os ratos...(au). / Purpose: Nestin is an intermediate filament component protein and can be used as an indicator of cellular immaturity. In the adult differentiated cell, nestin is replaced for other intermediate filament protein specific of the referred tissue. However, nestin re-expression can be induced by regenerative and/or degenerative conditions. In this way, in order to try to elucidate the plastic alterations followed by brain damage provoked by status epilepticus (SE) induced by pilocarpine in rats, the present work has the following purposes: Ia) Evaluate the physiological hippocampal and cortical nestin expression in rats from P9 to adulthood (P90); Ib) Evaluate hippocampal and cortical alterations of nestin expression in rats submitted to three episodes of SE induced by pilocarpine (P7,P8,P9). These animals were studied from P9 to P90; II) Evaluate the hippocampal temporal and spatial nestin expression of the adult rats submitted to the pilocarpine model of epilepsy (acute, silent and chronic phases); III) Evaluate the hippocampal nestin expression in aged normal rats and in aged rats with epilepsy. The aged chronic rats were submitted to the pilocarpine SE when young adults and they were studied with two years old. Methods: The SE was induced by pilocarpine injection (ip) and nestin expression was studied by immunohistochemistry. Results: Nestin expression was found in cortical radial glia, hippocampal fibers and blood vessels during early postnatal development, disappearing in the adulthood. Rats submitted to pilocarpine SE (P7-P9) showed a delayed nestin down-regulation in the cortical radial glia as well as in the blood vessels, when compared to their controls. We still found cortical radial glia in the experimental rats of P21 group, however they are not found anymore under normal physiological conditions at this age. Referring to the hippocampal reactive astrocytes expressing nestin in the adult rats submitted to the pilocarpine model, we did not detect nestin expression in the rats of the control and acute groups. In other hand, the animals of the silent group presented intense nestin expression 3 and 7 days after SE. Interestingly, still in the silent phase, we did not find any nestin expression 14 days after SE. However, in the 65 chronic phase of the model, the reactive astrocytes expressing nestin are again observed and they were sparsely distributed for all the hippocampal formation. The aged rats of the control group did not present nestin expression. However, aged chronic rats presenting long term epilepsy showed the same pattern of nestin immunoreactivity as observed in the chronic adult rats. Conclusions: This work showed that physiological nestin expression during early postnatal development to adulthood. Nestin immunoreactivity was intense in the cortical radial glia, hippocampal fibers and blood vessels during the early postnatal development disapearing in adulthood. Our data shoed that nestin expression was delayed in the rats submitted to SE (P7-9), suggesting a normal development impairment. We still found cortical radial glia in P21 in the experimental animals, suggesting a retardation of nestin down-regulation. The adult rats of the silent phase of the pilocarpine model presented transient nestin expression in the reactive astrocytes. However, reactive astrocytes expressing nestin were still found in the chronic phase of the model. These data suggest that nestin plays a role in the plastic events in the adult tissue after brain damage. The normal aging did not induce nestin re-expression. However, aged rats have the potential to re-express a developmental protein of immature cell, since the chronic aged rats in this study presented hippocampal reactive astrocytes. In this way, the knowledge of a temporal window of proteins such as nestin, with multi-potential and regenerative potential, allows advances in neurobiology understanding and contributes to the progress of cellular therapy in neurological diseases. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

No presente estudo nós investigamos o efeito in vivo da injeção intraestriatal de ácido quinolínico (AQ) sobre proteínas do citoesqueleto de astrócitos e neurônios de ratos jovens 30 minutos após a infusão. Injeção intraestriatal de AQ é um modelo excitotóxico da doença de Huntington (DH). Nossos resultados mostraram que o AQ (150μmol/0.5μL) aumentou significativamente a fosforilação in vitro da subunidade de baixo peso molecular dos neurofilamentos (NF-L) e da proteina glial fibrilar ácida (GFAP) de neurônios e astrócitos, respectivamente. Este efeito foi mediado pela proteína quinase AMPc-dependente (PKA), proteina quinase C (PKC) e proteina quinase Ca2+/calmodulina-dependente II (PKCaMII). Em contraste, proteínas quinases ativadas por mitógeno (MAPK) não foram ativadas pela infusão com AQ. Além disso, o pré-tratamento com MK-801 (0.25 mg/kg i.p), antagonista específico dos receptores N-metil-D-aspartato (NMDA); com o antioxidante L-NAME (60 mg\kg\day) e com o difenildisseleneto (PheSe)2 (0.625 mg\kg\dia) preveniram totalmente a hiperfosforilação induzida pelo AQ. Nós também observamos que o sítio de fosforilação Ser55 localizado no domínio N-terminal da NF-L, descrito como um sítio regulatório da associação dos NF in vivo, foi alvo da hiperfosforilação induzida pelo AQ. Este efeito foi totalmente prevenido por MK801, pelo inibidor de PKA, H89 e pelo (PheSe)2, enquanto que staurosporina, um inibidor de PKC, preveniu apenas parcialmente a fosforilação da Ser55. O inibidor de PKCaMII (KN93) e o antioxidante L-NAME não preveniram a hiperfosforilação da Ser55 pelo AQ. Portanto, nós presumimos que a hiperfosforilação da NF-LSer55 pode representar os primeiros passos na cascata fisiopatológica dos eventos deletérios exercidos pelo AQ no estriado de ratos. Nossas observações também indicam que os eventos mediados pelo receptor NMDA e por estresse oxidativo podem estar relacionados com a hiperfosforilação das proteínas do citoesqueleto observadas, com importantes implicações para as funções cerebrais. / In the present study we investigated the effect of in vivo intrastriatal injection of quinolinic acid (QA) on rat cytoskeleton proteins in astrocytes and neurons of young rats at early stages (30 min) after infusion. Intrastriatal QA injection is an excitotoxic model of Huntington´s Disease (HD). Results showed that QA (150μmol/0.5μL) significantly increased the in vitro phosphorylation of the low molecular weight neurofilament subunit (NF-L) and the glial fibrillary acidic protein (GFAP) of neurons and astrocytes, respectively. This effect was mediated by cAMP-dependent protein kinase A (PKA), protein kinase C (PKC) and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II (PKCaMII). In contrast, mitogen activated protein kinases (MAPK) were not activated by QA infusion. Furthermore, the specific N-methyl-D-aspartate (NMDA) antagonist MK-801 (0.25 mg/kg i.p), the antioxidant L-NAME (60 mg\kg\day), and diphenyldiselenide (PheSe)2 (0.625 mg\kg\day) injected prior to QA infusion totally prevented QA-induced hyperphosphorylation of cytoskeletal proteins. We also observed that QA-induced hyperphosphorylation was targeted at the Ser55 phosphorylating site on NF-L head domain, described as a regulatory site for NF assembly in vivo. This effect was fully prevented by MK801, by the PKA inhibitor H89 and by (PheSe)2, whereas staurosporine (PKC inhibitor) only partially prevented Ser55 phosphorylation. The PKCaMII inhibitor (KN93) and the antioxidant L-NAME failed to prevent the hyperphosphorylation of Ser55 by QA infusion. Therefore, we presume that QA-elicited NF-LSer55 hyperphosphorylation of the neural cytoskeleton achieved by intrastriatal QA injection could represent an early step in the pathophysiological cascade of deleterious events exerted by QA in rat striatum. Our observations also indicate that NMDA-mediated Ca2+ events and oxidative stress may be related to the altered protein cytoskeleton hyperphosphorylation observed with important implications for brain function.

Uma elevação da concentração de amônia no sangue é tóxica e pode levar a convulsões, coma e morte. A suscetibilidade do cérebro em desenvolvimento a alterações neurológicas é maior do que no adulto. O citoesqueleto e, em particular, os filamentos intermediários (FIs) são um alvo de neurotoxinas e metabólitos tóxicos. No SNC temos os FIs neuronais, representados pelos neurofilamentos de alto, médio e baixo peso molecular (NF-H, NF-M, NF-L), e os astrocitários, proteína glial fibrilar ácida e vimentina (GFAP e VIM), entre outros. A fosforilação é uma modificação pós-traducional bem descrita como um dos principais mecanismos de regulação da dinâmica dos FIs. No presente trabalho, estudamos os efeitos de concentrações tóxicas de amônia sobre o citoesqueleto, com ênfase na homeostase do sistema fosforilante direcionado para os FIs e alguns mecanismos moleculares envolvidos nesses efeitos. Para tanto, utilizamos dois modelos experimentais de hiperamonemia aguda em animais de 10 e 21 dias de idade: in vivo e in vitro. No modelo in vivo, os animais foram injetados intraperitonealmente com acetato de amônio (7 mmol/Kg) e o nível de fosforilação das proteínas do citoesqueleto foi analisado no córtex cerebral e no hipocampo. No modelo in vitro, fatias de córtex cerebral e hipocampo de ratos nas mesmas idades foram incubadas com diferentes concentrações de NH4Cl. Nos dois modelos experimentais utilizados as alterações no sistema fosforilante foram dependentes da idade e da estrutura cerebral. A injeção de acetato de amônio não alterou o nível de fosforilação dos FIs no córtex cerebral de ratos de 10 dias, 30 e 60 min após a injeção. No entanto, observamos hipofosforilação dos FIs astrocitários (GFAP e VIM) e neuronais (NF-L, NF-M e NF-H) 30 min após a injeção, sendo que esse efeito foi revertido 60 min após a injeção. O sistema fosforilante associado aos FIs das células neurais de hipocampo não foi alterado com relação aos controles nas duas idades e nos dois tempos estudados. No modelo in vitro a resposta ao NH4Cl foi estrutura-dependente e dose-dependente para as concentrações de 0,5, 1 e 5 mM. Fatias de hipocampo de ratos de 10 dias de idade apresentaram hipofosforilação de GFAP, VIM e NFL em resposta à incubação com 5 mM de NH4Cl, sem alteração na homeostase do citoesqueleto nas células neurais de córtex cerebral. Por outro lado, fatias de córtex cerebral de ratos de 21 dias de idade apresentaram hipofosforilação dos FIs astrocitários (GFAP e VIM) sem alteração no sistema fosforilante direcionado aos FIs de hipocampo. A hipofosforilação em resposta a sinais celulares está frequentemente associada à ativação de proteínas fosfatases. Portanto, em uma tentativa de estudar as vias de sinalização buscamos identificar as fosfatases envolvidas no efeito do NH4Cl, utilizando fatias de córtex cerebral. As proteínas fosfatases 1 (PP1) e 2B (PP2B) foram ativadas em resposta a 5 mM de NH4Cl aos 30 min e esse evento envolveu alterações nos níveis intra e extracelulares de Ca2+ via ativação do sistema glutamatérgico por receptores N-metil-D-aspartato (NMDA). O conjunto dos nossos dados evidenciam a neurotoxicidade da amônia por meio de um desequilíbrio no sistema fosforilante direcionado para os FIs tanto neuronais quanto astrocitários e de uma desregulação nos mecanismos de sinalização celular envolvidos na homeostase do citoesqueleto de astrócitos. Essas alterações podem ser parte integrante dos danos neurológicos associados à hiperamonemia aguda, principalmente no cérebro em desenvolvimento, como retardo mental e paralisia cerebral. Acreditamos que esses resultados são relevantes para a compreensão das bases moleculares envolvidas com a toxicidade da amônia no SNC. / High ammonia levels in the blood are toxic to brain and can lead to seizures, coma and death. The susceptibility of the developing brain to neurological abnormalities is greater than in adults. The cytoskeleton and, in particular, the intermediate filaments (IFs) are a target of neurotoxins and toxic metabolites. The intermediate dilaments (IFs) in the CNS are mainly represented by neurofilaments of high, medium and light molecular weight (NF-H, NF-M, NF-L) in neurons, glial fibrillary acidic protein and vimentin (GFAP and VIM), in astrocytes. Phosphorylation is a post-translational modification described as one of the major mechanisms regulating the dynamics of IFs. In the present work, we studied the effects of toxic concentrations of ammonia on the cytoskeleton, with emphasis in the homeostasis of the phosphorylating system directed to the IFs and we focused in some molecular mechanisms involved in these effects. For this, we use two experimental models of acute hyperammonemia in animals of 10 and 21 days of age: in vivo and in vitro models. In the in vivo model, animals were injected intraperitoneally with ammonium acetate (7 mmol/Kg) and the phosphorylation level of the cytoskeletal proteins was analyzed in the cerebral cortex and hippocampus.The injected acetate did not alter the phosphorylation level of IFs in the cerebral cortex of 10 day-old rats, 30 and 60 min after injection. However, we noted hypophosphorylation of the astrocytic (GFAP and VIM) as well as neuronal IFs (NF-L, NF-M and NF-H) 30 min after injection, and this effect was reversed 60 min after injection. The phosphorylating system associated with IFs of neural cells of the hippocampus was not altered as compared with controls at both ages and in the two studied times. In the in vitro model, the response to NH4Cl was structure-dependent and dose-dependent at the concentrations of 0.5, 1 and 5 mM. Hippocampal slices of 10-day-old rats showed hypophosphorylation of GFAP VIM and NFL in response to incubation with 5 mM NH4Cl, and unaltered homeostasis of the phosphorylating system directed to the cytoskeleton in the neural cells of the cerebral cortex. On the other hand, slices of cerebral cortex of 21-day-old rats showed hypophosphorylation of astrocytic IFs (GFAP and VIM) without altering the phosphorylating system directed to hippocampal IFs. The hypophosphorylation in response to cellular signals is often associated with activation of protein phosphatases. Therefore, in an attempt to study the signaling pathways we seek identify phosphatases involved in the effect of NH4Cl, using cerebral cortex slices. The protein phosphatases 1 (PP1) and 2B (PP2B) were activated in response to 5 mM NH4Cl 30 min after injection and this event was associated with in intra and extracellular Ca2+ levels via activation of glutamate N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. Taken together, our data show that the neurotoxicity of ammonia is directed to the phosphorylating imbalance of both neuronal as astrocytic IFs through disruption of the homeostasis of the NMDA-mediated signaling mechanisms of cortical astrocytes of 21-day-old rats. These changes may be part of the neurological damage associated with acute hyperammonemia, in the developing brain, as mental retardation and cerebral palsy. We believe that these results are relevant for understanding the molecular basis involved in the toxicity of ammonia in the CNS.

Uma elevação da concentração de amônia no sangue é tóxica e pode levar a convulsões, coma e morte. A suscetibilidade do cérebro em desenvolvimento a alterações neurológicas é maior do que no adulto. O citoesqueleto e, em particular, os filamentos intermediários (FIs) são um alvo de neurotoxinas e metabólitos tóxicos. No SNC temos os FIs neuronais, representados pelos neurofilamentos de alto, médio e baixo peso molecular (NF-H, NF-M, NF-L), e os astrocitários, proteína glial fibrilar ácida e vimentina (GFAP e VIM), entre outros. A fosforilação é uma modificação pós-traducional bem descrita como um dos principais mecanismos de regulação da dinâmica dos FIs. No presente trabalho, estudamos os efeitos de concentrações tóxicas de amônia sobre o citoesqueleto, com ênfase na homeostase do sistema fosforilante direcionado para os FIs e alguns mecanismos moleculares envolvidos nesses efeitos. Para tanto, utilizamos dois modelos experimentais de hiperamonemia aguda em animais de 10 e 21 dias de idade: in vivo e in vitro. No modelo in vivo, os animais foram injetados intraperitonealmente com acetato de amônio (7 mmol/Kg) e o nível de fosforilação das proteínas do citoesqueleto foi analisado no córtex cerebral e no hipocampo. No modelo in vitro, fatias de córtex cerebral e hipocampo de ratos nas mesmas idades foram incubadas com diferentes concentrações de NH4Cl. Nos dois modelos experimentais utilizados as alterações no sistema fosforilante foram dependentes da idade e da estrutura cerebral. A injeção de acetato de amônio não alterou o nível de fosforilação dos FIs no córtex cerebral de ratos de 10 dias, 30 e 60 min após a injeção. No entanto, observamos hipofosforilação dos FIs astrocitários (GFAP e VIM) e neuronais (NF-L, NF-M e NF-H) 30 min após a injeção, sendo que esse efeito foi revertido 60 min após a injeção. O sistema fosforilante associado aos FIs das células neurais de hipocampo não foi alterado com relação aos controles nas duas idades e nos dois tempos estudados. No modelo in vitro a resposta ao NH4Cl foi estrutura-dependente e dose-dependente para as concentrações de 0,5, 1 e 5 mM. Fatias de hipocampo de ratos de 10 dias de idade apresentaram hipofosforilação de GFAP, VIM e NFL em resposta à incubação com 5 mM de NH4Cl, sem alteração na homeostase do citoesqueleto nas células neurais de córtex cerebral. Por outro lado, fatias de córtex cerebral de ratos de 21 dias de idade apresentaram hipofosforilação dos FIs astrocitários (GFAP e VIM) sem alteração no sistema fosforilante direcionado aos FIs de hipocampo. A hipofosforilação em resposta a sinais celulares está frequentemente associada à ativação de proteínas fosfatases. Portanto, em uma tentativa de estudar as vias de sinalização buscamos identificar as fosfatases envolvidas no efeito do NH4Cl, utilizando fatias de córtex cerebral. As proteínas fosfatases 1 (PP1) e 2B (PP2B) foram ativadas em resposta a 5 mM de NH4Cl aos 30 min e esse evento envolveu alterações nos níveis intra e extracelulares de Ca2+ via ativação do sistema glutamatérgico por receptores N-metil-D-aspartato (NMDA). O conjunto dos nossos dados evidenciam a neurotoxicidade da amônia por meio de um desequilíbrio no sistema fosforilante direcionado para os FIs tanto neuronais quanto astrocitários e de uma desregulação nos mecanismos de sinalização celular envolvidos na homeostase do citoesqueleto de astrócitos. Essas alterações podem ser parte integrante dos danos neurológicos associados à hiperamonemia aguda, principalmente no cérebro em desenvolvimento, como retardo mental e paralisia cerebral. Acreditamos que esses resultados são relevantes para a compreensão das bases moleculares envolvidas com a toxicidade da amônia no SNC. / High ammonia levels in the blood are toxic to brain and can lead to seizures, coma and death. The susceptibility of the developing brain to neurological abnormalities is greater than in adults. The cytoskeleton and, in particular, the intermediate filaments (IFs) are a target of neurotoxins and toxic metabolites. The intermediate dilaments (IFs) in the CNS are mainly represented by neurofilaments of high, medium and light molecular weight (NF-H, NF-M, NF-L) in neurons, glial fibrillary acidic protein and vimentin (GFAP and VIM), in astrocytes. Phosphorylation is a post-translational modification described as one of the major mechanisms regulating the dynamics of IFs. In the present work, we studied the effects of toxic concentrations of ammonia on the cytoskeleton, with emphasis in the homeostasis of the phosphorylating system directed to the IFs and we focused in some molecular mechanisms involved in these effects. For this, we use two experimental models of acute hyperammonemia in animals of 10 and 21 days of age: in vivo and in vitro models. In the in vivo model, animals were injected intraperitoneally with ammonium acetate (7 mmol/Kg) and the phosphorylation level of the cytoskeletal proteins was analyzed in the cerebral cortex and hippocampus.The injected acetate did not alter the phosphorylation level of IFs in the cerebral cortex of 10 day-old rats, 30 and 60 min after injection. However, we noted hypophosphorylation of the astrocytic (GFAP and VIM) as well as neuronal IFs (NF-L, NF-M and NF-H) 30 min after injection, and this effect was reversed 60 min after injection. The phosphorylating system associated with IFs of neural cells of the hippocampus was not altered as compared with controls at both ages and in the two studied times. In the in vitro model, the response to NH4Cl was structure-dependent and dose-dependent at the concentrations of 0.5, 1 and 5 mM. Hippocampal slices of 10-day-old rats showed hypophosphorylation of GFAP VIM and NFL in response to incubation with 5 mM NH4Cl, and unaltered homeostasis of the phosphorylating system directed to the cytoskeleton in the neural cells of the cerebral cortex. On the other hand, slices of cerebral cortex of 21-day-old rats showed hypophosphorylation of astrocytic IFs (GFAP and VIM) without altering the phosphorylating system directed to hippocampal IFs. The hypophosphorylation in response to cellular signals is often associated with activation of protein phosphatases. Therefore, in an attempt to study the signaling pathways we seek identify phosphatases involved in the effect of NH4Cl, using cerebral cortex slices. The protein phosphatases 1 (PP1) and 2B (PP2B) were activated in response to 5 mM NH4Cl 30 min after injection and this event was associated with in intra and extracellular Ca2+ levels via activation of glutamate N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. Taken together, our data show that the neurotoxicity of ammonia is directed to the phosphorylating imbalance of both neuronal as astrocytic IFs through disruption of the homeostasis of the NMDA-mediated signaling mechanisms of cortical astrocytes of 21-day-old rats. These changes may be part of the neurological damage associated with acute hyperammonemia, in the developing brain, as mental retardation and cerebral palsy. We believe that these results are relevant for understanding the molecular basis involved in the toxicity of ammonia in the CNS.

No presente estudo nós investigamos o efeito in vivo da injeção intraestriatal de ácido quinolínico (AQ) sobre proteínas do citoesqueleto de astrócitos e neurônios de ratos jovens 30 minutos após a infusão. Injeção intraestriatal de AQ é um modelo excitotóxico da doença de Huntington (DH). Nossos resultados mostraram que o AQ (150μmol/0.5μL) aumentou significativamente a fosforilação in vitro da subunidade de baixo peso molecular dos neurofilamentos (NF-L) e da proteina glial fibrilar ácida (GFAP) de neurônios e astrócitos, respectivamente. Este efeito foi mediado pela proteína quinase AMPc-dependente (PKA), proteina quinase C (PKC) e proteina quinase Ca2+/calmodulina-dependente II (PKCaMII). Em contraste, proteínas quinases ativadas por mitógeno (MAPK) não foram ativadas pela infusão com AQ. Além disso, o pré-tratamento com MK-801 (0.25 mg/kg i.p), antagonista específico dos receptores N-metil-D-aspartato (NMDA); com o antioxidante L-NAME (60 mg\kg\day) e com o difenildisseleneto (PheSe)2 (0.625 mg\kg\dia) preveniram totalmente a hiperfosforilação induzida pelo AQ. Nós também observamos que o sítio de fosforilação Ser55 localizado no domínio N-terminal da NF-L, descrito como um sítio regulatório da associação dos NF in vivo, foi alvo da hiperfosforilação induzida pelo AQ. Este efeito foi totalmente prevenido por MK801, pelo inibidor de PKA, H89 e pelo (PheSe)2, enquanto que staurosporina, um inibidor de PKC, preveniu apenas parcialmente a fosforilação da Ser55. O inibidor de PKCaMII (KN93) e o antioxidante L-NAME não preveniram a hiperfosforilação da Ser55 pelo AQ. Portanto, nós presumimos que a hiperfosforilação da NF-LSer55 pode representar os primeiros passos na cascata fisiopatológica dos eventos deletérios exercidos pelo AQ no estriado de ratos. Nossas observações também indicam que os eventos mediados pelo receptor NMDA e por estresse oxidativo podem estar relacionados com a hiperfosforilação das proteínas do citoesqueleto observadas, com importantes implicações para as funções cerebrais. / In the present study we investigated the effect of in vivo intrastriatal injection of quinolinic acid (QA) on rat cytoskeleton proteins in astrocytes and neurons of young rats at early stages (30 min) after infusion. Intrastriatal QA injection is an excitotoxic model of Huntington´s Disease (HD). Results showed that QA (150μmol/0.5μL) significantly increased the in vitro phosphorylation of the low molecular weight neurofilament subunit (NF-L) and the glial fibrillary acidic protein (GFAP) of neurons and astrocytes, respectively. This effect was mediated by cAMP-dependent protein kinase A (PKA), protein kinase C (PKC) and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II (PKCaMII). In contrast, mitogen activated protein kinases (MAPK) were not activated by QA infusion. Furthermore, the specific N-methyl-D-aspartate (NMDA) antagonist MK-801 (0.25 mg/kg i.p), the antioxidant L-NAME (60 mg\kg\day), and diphenyldiselenide (PheSe)2 (0.625 mg\kg\day) injected prior to QA infusion totally prevented QA-induced hyperphosphorylation of cytoskeletal proteins. We also observed that QA-induced hyperphosphorylation was targeted at the Ser55 phosphorylating site on NF-L head domain, described as a regulatory site for NF assembly in vivo. This effect was fully prevented by MK801, by the PKA inhibitor H89 and by (PheSe)2, whereas staurosporine (PKC inhibitor) only partially prevented Ser55 phosphorylation. The PKCaMII inhibitor (KN93) and the antioxidant L-NAME failed to prevent the hyperphosphorylation of Ser55 by QA infusion. Therefore, we presume that QA-elicited NF-LSer55 hyperphosphorylation of the neural cytoskeleton achieved by intrastriatal QA injection could represent an early step in the pathophysiological cascade of deleterious events exerted by QA in rat striatum. Our observations also indicate that NMDA-mediated Ca2+ events and oxidative stress may be related to the altered protein cytoskeleton hyperphosphorylation observed with important implications for brain function.

No presente estudo nós investigamos o efeito in vivo da injeção intraestriatal de ácido quinolínico (AQ) sobre proteínas do citoesqueleto de astrócitos e neurônios de ratos jovens 30 minutos após a infusão. Injeção intraestriatal de AQ é um modelo excitotóxico da doença de Huntington (DH). Nossos resultados mostraram que o AQ (150μmol/0.5μL) aumentou significativamente a fosforilação in vitro da subunidade de baixo peso molecular dos neurofilamentos (NF-L) e da proteina glial fibrilar ácida (GFAP) de neurônios e astrócitos, respectivamente. Este efeito foi mediado pela proteína quinase AMPc-dependente (PKA), proteina quinase C (PKC) e proteina quinase Ca2+/calmodulina-dependente II (PKCaMII). Em contraste, proteínas quinases ativadas por mitógeno (MAPK) não foram ativadas pela infusão com AQ. Além disso, o pré-tratamento com MK-801 (0.25 mg/kg i.p), antagonista específico dos receptores N-metil-D-aspartato (NMDA); com o antioxidante L-NAME (60 mg\kg\day) e com o difenildisseleneto (PheSe)2 (0.625 mg\kg\dia) preveniram totalmente a hiperfosforilação induzida pelo AQ. Nós também observamos que o sítio de fosforilação Ser55 localizado no domínio N-terminal da NF-L, descrito como um sítio regulatório da associação dos NF in vivo, foi alvo da hiperfosforilação induzida pelo AQ. Este efeito foi totalmente prevenido por MK801, pelo inibidor de PKA, H89 e pelo (PheSe)2, enquanto que staurosporina, um inibidor de PKC, preveniu apenas parcialmente a fosforilação da Ser55. O inibidor de PKCaMII (KN93) e o antioxidante L-NAME não preveniram a hiperfosforilação da Ser55 pelo AQ. Portanto, nós presumimos que a hiperfosforilação da NF-LSer55 pode representar os primeiros passos na cascata fisiopatológica dos eventos deletérios exercidos pelo AQ no estriado de ratos. Nossas observações também indicam que os eventos mediados pelo receptor NMDA e por estresse oxidativo podem estar relacionados com a hiperfosforilação das proteínas do citoesqueleto observadas, com importantes implicações para as funções cerebrais. / In the present study we investigated the effect of in vivo intrastriatal injection of quinolinic acid (QA) on rat cytoskeleton proteins in astrocytes and neurons of young rats at early stages (30 min) after infusion. Intrastriatal QA injection is an excitotoxic model of Huntington´s Disease (HD). Results showed that QA (150μmol/0.5μL) significantly increased the in vitro phosphorylation of the low molecular weight neurofilament subunit (NF-L) and the glial fibrillary acidic protein (GFAP) of neurons and astrocytes, respectively. This effect was mediated by cAMP-dependent protein kinase A (PKA), protein kinase C (PKC) and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II (PKCaMII). In contrast, mitogen activated protein kinases (MAPK) were not activated by QA infusion. Furthermore, the specific N-methyl-D-aspartate (NMDA) antagonist MK-801 (0.25 mg/kg i.p), the antioxidant L-NAME (60 mg\kg\day), and diphenyldiselenide (PheSe)2 (0.625 mg\kg\day) injected prior to QA infusion totally prevented QA-induced hyperphosphorylation of cytoskeletal proteins. We also observed that QA-induced hyperphosphorylation was targeted at the Ser55 phosphorylating site on NF-L head domain, described as a regulatory site for NF assembly in vivo. This effect was fully prevented by MK801, by the PKA inhibitor H89 and by (PheSe)2, whereas staurosporine (PKC inhibitor) only partially prevented Ser55 phosphorylation. The PKCaMII inhibitor (KN93) and the antioxidant L-NAME failed to prevent the hyperphosphorylation of Ser55 by QA infusion. Therefore, we presume that QA-elicited NF-LSer55 hyperphosphorylation of the neural cytoskeleton achieved by intrastriatal QA injection could represent an early step in the pathophysiological cascade of deleterious events exerted by QA in rat striatum. Our observations also indicate that NMDA-mediated Ca2+ events and oxidative stress may be related to the altered protein cytoskeleton hyperphosphorylation observed with important implications for brain function.

Uma elevação da concentração de amônia no sangue é tóxica e pode levar a convulsões, coma e morte. A suscetibilidade do cérebro em desenvolvimento a alterações neurológicas é maior do que no adulto. O citoesqueleto e, em particular, os filamentos intermediários (FIs) são um alvo de neurotoxinas e metabólitos tóxicos. No SNC temos os FIs neuronais, representados pelos neurofilamentos de alto, médio e baixo peso molecular (NF-H, NF-M, NF-L), e os astrocitários, proteína glial fibrilar ácida e vimentina (GFAP e VIM), entre outros. A fosforilação é uma modificação pós-traducional bem descrita como um dos principais mecanismos de regulação da dinâmica dos FIs. No presente trabalho, estudamos os efeitos de concentrações tóxicas de amônia sobre o citoesqueleto, com ênfase na homeostase do sistema fosforilante direcionado para os FIs e alguns mecanismos moleculares envolvidos nesses efeitos. Para tanto, utilizamos dois modelos experimentais de hiperamonemia aguda em animais de 10 e 21 dias de idade: in vivo e in vitro. No modelo in vivo, os animais foram injetados intraperitonealmente com acetato de amônio (7 mmol/Kg) e o nível de fosforilação das proteínas do citoesqueleto foi analisado no córtex cerebral e no hipocampo. No modelo in vitro, fatias de córtex cerebral e hipocampo de ratos nas mesmas idades foram incubadas com diferentes concentrações de NH4Cl. Nos dois modelos experimentais utilizados as alterações no sistema fosforilante foram dependentes da idade e da estrutura cerebral. A injeção de acetato de amônio não alterou o nível de fosforilação dos FIs no córtex cerebral de ratos de 10 dias, 30 e 60 min após a injeção. No entanto, observamos hipofosforilação dos FIs astrocitários (GFAP e VIM) e neuronais (NF-L, NF-M e NF-H) 30 min após a injeção, sendo que esse efeito foi revertido 60 min após a injeção. O sistema fosforilante associado aos FIs das células neurais de hipocampo não foi alterado com relação aos controles nas duas idades e nos dois tempos estudados. No modelo in vitro a resposta ao NH4Cl foi estrutura-dependente e dose-dependente para as concentrações de 0,5, 1 e 5 mM. Fatias de hipocampo de ratos de 10 dias de idade apresentaram hipofosforilação de GFAP, VIM e NFL em resposta à incubação com 5 mM de NH4Cl, sem alteração na homeostase do citoesqueleto nas células neurais de córtex cerebral. Por outro lado, fatias de córtex cerebral de ratos de 21 dias de idade apresentaram hipofosforilação dos FIs astrocitários (GFAP e VIM) sem alteração no sistema fosforilante direcionado aos FIs de hipocampo. A hipofosforilação em resposta a sinais celulares está frequentemente associada à ativação de proteínas fosfatases. Portanto, em uma tentativa de estudar as vias de sinalização buscamos identificar as fosfatases envolvidas no efeito do NH4Cl, utilizando fatias de córtex cerebral. As proteínas fosfatases 1 (PP1) e 2B (PP2B) foram ativadas em resposta a 5 mM de NH4Cl aos 30 min e esse evento envolveu alterações nos níveis intra e extracelulares de Ca2+ via ativação do sistema glutamatérgico por receptores N-metil-D-aspartato (NMDA). O conjunto dos nossos dados evidenciam a neurotoxicidade da amônia por meio de um desequilíbrio no sistema fosforilante direcionado para os FIs tanto neuronais quanto astrocitários e de uma desregulação nos mecanismos de sinalização celular envolvidos na homeostase do citoesqueleto de astrócitos. Essas alterações podem ser parte integrante dos danos neurológicos associados à hiperamonemia aguda, principalmente no cérebro em desenvolvimento, como retardo mental e paralisia cerebral. Acreditamos que esses resultados são relevantes para a compreensão das bases moleculares envolvidas com a toxicidade da amônia no SNC. / High ammonia levels in the blood are toxic to brain and can lead to seizures, coma and death. The susceptibility of the developing brain to neurological abnormalities is greater than in adults. The cytoskeleton and, in particular, the intermediate filaments (IFs) are a target of neurotoxins and toxic metabolites. The intermediate dilaments (IFs) in the CNS are mainly represented by neurofilaments of high, medium and light molecular weight (NF-H, NF-M, NF-L) in neurons, glial fibrillary acidic protein and vimentin (GFAP and VIM), in astrocytes. Phosphorylation is a post-translational modification described as one of the major mechanisms regulating the dynamics of IFs. In the present work, we studied the effects of toxic concentrations of ammonia on the cytoskeleton, with emphasis in the homeostasis of the phosphorylating system directed to the IFs and we focused in some molecular mechanisms involved in these effects. For this, we use two experimental models of acute hyperammonemia in animals of 10 and 21 days of age: in vivo and in vitro models. In the in vivo model, animals were injected intraperitoneally with ammonium acetate (7 mmol/Kg) and the phosphorylation level of the cytoskeletal proteins was analyzed in the cerebral cortex and hippocampus.The injected acetate did not alter the phosphorylation level of IFs in the cerebral cortex of 10 day-old rats, 30 and 60 min after injection. However, we noted hypophosphorylation of the astrocytic (GFAP and VIM) as well as neuronal IFs (NF-L, NF-M and NF-H) 30 min after injection, and this effect was reversed 60 min after injection. The phosphorylating system associated with IFs of neural cells of the hippocampus was not altered as compared with controls at both ages and in the two studied times. In the in vitro model, the response to NH4Cl was structure-dependent and dose-dependent at the concentrations of 0.5, 1 and 5 mM. Hippocampal slices of 10-day-old rats showed hypophosphorylation of GFAP VIM and NFL in response to incubation with 5 mM NH4Cl, and unaltered homeostasis of the phosphorylating system directed to the cytoskeleton in the neural cells of the cerebral cortex. On the other hand, slices of cerebral cortex of 21-day-old rats showed hypophosphorylation of astrocytic IFs (GFAP and VIM) without altering the phosphorylating system directed to hippocampal IFs. The hypophosphorylation in response to cellular signals is often associated with activation of protein phosphatases. Therefore, in an attempt to study the signaling pathways we seek identify phosphatases involved in the effect of NH4Cl, using cerebral cortex slices. The protein phosphatases 1 (PP1) and 2B (PP2B) were activated in response to 5 mM NH4Cl 30 min after injection and this event was associated with in intra and extracellular Ca2+ levels via activation of glutamate N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. Taken together, our data show that the neurotoxicity of ammonia is directed to the phosphorylating imbalance of both neuronal as astrocytic IFs through disruption of the homeostasis of the NMDA-mediated signaling mechanisms of cortical astrocytes of 21-day-old rats. These changes may be part of the neurological damage associated with acute hyperammonemia, in the developing brain, as mental retardation and cerebral palsy. We believe that these results are relevant for understanding the molecular basis involved in the toxicity of ammonia in the CNS.

Septinas são proteínas que ligam GTP e interagem entre si formando heterocomplexos, os quais se organizam em filamentos e estruturas de maior nível de organização. Em humanos são encontrados 13 genes que codificam septinas, as quais se dividem em 4 grupos com base na similaridade de sua organização estrutural. Análises filogenéticas identificaram quatro septinas ortólogas no deuterostômio Ciona intestinalis, as quais apresentam, cada uma, identidade com um dos quatro grupos de septinas de mamíferos. Tais proteínas foram nomeadas CiSEPT2, CiSEPT6, CiSEPT7 e CiSEPT9 devido a identidade com as septinas humanas. Sabe-se que septinas de diferentes grupos interagem entre si formando heterocomplexos e, assim, a possibilidade de formar um oligômero único em C. intestinalis permite um modelo mais simples para o estudo da organização dos filamentos. Análises de bioinformática identificaram nessas proteínas motivos estruturais típicos de septinas, incluindo resíduos conservados para a ligação e hidrólise do GTP. As proteínas foram produzidas de forma heteróloga e a capacidade hidrolítica tanto de CiSEPT2 como de CiSEPT7 foiram confirmadas diretamente. Em contrapartida, CiSEPT6 não apresentou atividade catalítica. Um sistema de coexpressão foi construído no qual as quatro septinas de C. intestinalis foram co-expressas e co-purificadas em diferentes arranjos, resultando na formação de heterocomplexos parciais além daquele contendo as quatro subunidades. A avaliação do estado oligomérico dos heterocomplexos parciais mostrou que estes correspondem majoritariamente a tetrâmeros e hexâmeros quando formados, respectivamente, por duas ou três subunidades. Estes oligômeros foram analisados por microscopia eletrônica de transmissão (MET) em que se observou que os mesmos se dispõem na forma de um bastão. Ensaios ainda mostraram que a polimerização desses oligômeros é dependente de CiSEPT2 sugerindo que esta subunidade esteja possivelmente posicionada na extremidade do heterocomplexo. Adicionalmente, ensaios de polimerização realizados com o complexo CiSEPT2/6/7/9 revelaram que este é capaz de interagir com filamentos adjacentes, possivelmente via coiled-coil, formando estruturas de mais alta ordem, similar aos já observados em S. cerevisiae. Finalmente, experimentos utilizando termoforese em microescala (MST) mostraram uma maior afinidade de interação entre as subunidades quando oligômeros estão envolvidos, indicando que estes podem atuar como fator de nucleação para a formação dos heterocomplexos. Esse trabalho apresenta os primeiros estudos de caracterização das septinas de C. intestinalis mostrando a formação do heterocomplexo e representa um modelo simplificado e viável para estudos estruturais relativos a formação de filamentos de septinas. Assim, através de uma abordagem comparativa com complexos oriundos de outros organismos, este novo complexo poderá contribuir para a compreensão do mecanismo de montagem e controle da polimerização de septinas. / Septins are GTP-binding proteins that interact with each other forming heterocomplexes, filaments and higher order structures. The human genome encodes 13 septins, which are divided into 4 subgroups based on sequence similarity. Phylogenetic analysis demonstrated that only a single representative of each of these subgroups is present in the non-vertebrate chordate Ciona intestinalis. These proteins are named CiSEPT2, CiSEPT6, CiSEPT7 and CiSEPT9 due to their great similarity with human septins. Once septins from different subgroups are able to interact among themselves to form hetero-oligomeric complex, C. intestinalis representatives can be used as a simpler model for studies of septin complex assembly. Bioinformatics analysis identified typical structural motifs of septins in these proteins, including conserved residues for binding and hydrolysis of GTP. These septins were expressed and characterized biophysically and biochemically revealing that CiSEPT2 and CiSEPT7 are capable of hydrolyzing GTP. In contrast, CiSEPT6 showed no catalytic activity. A coexpression system were designed in which the four septins of C. intestinalis were co-expressed and co-purified in different arrangements, resulting the formation of partial heterocomplexes in addition to that containing the four subunits. The oligomeric state of the partial heterocomplexes were confirmed corresponding to tetramer and hexamers when formed, respectively, by two or three subunits. Transmission electron microscopy analysis revealed that these oligomers assemblies are rod-like structures. The polymerization of these oligomers is dependent on CiSEPT2 suggesting that this subunit occupies possibly the terminal positions of the heterocomplex. Additionally, polymerization assays performed with the CiSEPT2/6/7/9 complex revealed that it is capable of interacting with adjacent filaments, possibly via coiled-coil, forming higher order structures similar to those already reported in S. cerevisiae. Finally, the interaction strenght among C. intestinalis septins were determined using microscale thermoforesis (MST), revealing a higher binding affinity when titration involves small oligomers instead of monomers, indicating that these may act as a nucleating factor for heterocomplex assembly. This work constitutes the first characterization of C. intestinalis septins presenting the heterocomplex assembly and represents a simplified and potential model for structural studies regarding the filaments assembly of septins. Thus, comparative studies involving complexes from other organisms may contribute to the understanding of the assembly mechanism and polymerization control of septins.

Obter fibras por fiação em solução tem sido o método apropriado aos polímeros que se degradam em processos termoplásticos convencionais, como extrusão e injeção. A produção de fibras de poliacrilonitrila (PAN) tem sido realizada por este método, onde a principal característica é o uso de solventes tóxicos. Recentemente, um processo de extrusão termoplástica da PAN foi apresentado como uma inovação tecnológica que possibilita a fiação por fusão da PAN empregando o glicerol como plastificante. Esse processo possibilita obter fibras de PAN por custo inferior ao tradicionalmente utilizado e isento de toxidade. O presente trabalho aborda os principais aspectos relacionados à otimização do processo de fiação por fusão em extrusora e a caracterização térmica e mecânica das fibras de PAN extrudadas. A influência da adição do glicerol nas propriedades térmicas e viscoelásticas da PAN em análises por DSC, TG e DMA, foi analisada. O método de Kissinger foi usado para avaliação termocinética da PAN. Foram identificados os principais problemas do processo, como por exemplo, a elevada geração de gases durante os ensaios de fiação da PAN em extrusora tipo monorosca. Posteriormente, foi proposta uma extrusora do tipo cascata que resultou em fibras de PAN com título médio de até 18 dtex. Ensaios de tração realizados em monofilamentos de PAN extrudadas forneceram uma tenacidade de até 26 cN/tex. Ensaios em DMA, forneceram o módulo de Young médio entre 4 a 6 GPa para fibras de PAN com glicerol. Os resultados dos testes de tração para fibras de PAN foram coerentes aos valores obtidos em literatura. O aspecto da fratura criogênica das fibras de PAN extrudadas foi analisada por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e revelou uma estrutura fibrilar resultado do alinhamento de macromoléculas durante o processo de extrusão.

Os filmes finos dos óxidos de ZnO dopados com Co, preparados via método Pechini, são semicondutores magnéticos diluídos com grande potencial para serem empregados na fabricação de dispositivos spintrônicos. Filmes com concentrações nominais de 1, 3 e 5 %, em mol, de Co foram depositados por spin-coating sobre substratos de vidro e safira. Os filmes finos preparados foram caracterizados por difração de raios X, microscopia eletrônica de varredura, analise de EDS e absorção de raios X. Padrões de difração de raios X indicam que os filmes dopados com Co sobre substrato de vidro tem fase cristalina com a estrutura wurtzite. Espectros EXAFS sugerem que nos filmes com concentrações de 5% os átomos de cobalto não estão ocupando somente os sítios dos íons Zn2+ dentro da rede cristalina do ZnO. As espessuras dos filmes usando imagens de microscopia eletrônica de varredura ficaram entre os valores de 160 nm e 800 nm. Os procedimentos empregados no trabalho produziram filmes espessos e bem distribuídos pelas superfícies dos vidros. Os filmes depositados em substratos de safira não recobriram de forma uniforme a superfície dos substratos. / Co-Doped ZnO thin films, a diluted magnetic semiconductor with great potential to be used in the manufacture of spintronic devices, were prepared via Pechini method. Films with nominal concentrations of 1, 3 and 5 mols % of Co were depositions by spin-coating on glass and sapphire substrates. The prepared thin films were characterized by X-ray diffraction, scanning electron microscopy, EDS analysis and X-ray absorption. X-ray diffraction patterns indicated that the films doped with Co on the glass substrate has a crystalline phase with wurtzite structure. EXAFS spectra suggest that in thin films with concentrations of 5 mol% of Co, these atoms are not only occupying the Zn2 + ionic sites within the ZnO crystal lattice. The thicknesses of the films measured using images from scanning electron microscopy were between the values of 160 nm and 800 nm. The method and procedures employed in the work produced good films on glass substrates, thick and well distributed across the surface of the substrate one. The films deposited on sapphire substrates not uniformly covered the surface of the substrate. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES