Hyaluronan (HA) ist ein nicht sulfatiertes Glykosaminoglykan, welches in der dermalen Extrazellularmatrix eine große Rolle als wasserspeicherndes Molekül spielt. Nach aktuellem Forschungsstand wird dem HA auch eine entscheidende Bedeutung u.a. in der Zellkommunikation und der Gewebehomöostase zugesprochen. Auswirkungen eines deutlich verminderten HA-Gehalts auf die Dermis im Ruhezustand wurden bisher wenig beleuchtet. Klinisch führen die Applikation von Glucocorticoiden und Exposition mit ultraviolettem Licht zu diesem Zustand. Ziel der vorliegenden Arbeit war eine Teiluntersuchung der Folgen nach HA-Suppression auf die ECM der ruhenden Dermis und ihrer Zellen. Wir analysierten ebendiese am Mausmodell auf mRNA-, Protein- und mikroskopischer Ebene. Wir nahmen an, dass durch HA-Reduktion eine Reorganisation der ECM mit Induktion anderer ECM-Komponenten zur Kompensation des HA-Verlusts stattfindet. Mithilfe eines konditionalen Knockout-(KO)-Modells der murinen HA-Synthase Has2 konnten wir eine suffiziente HA-Reduktion im murinen in vivo-Gewebe erreichen. Histologisch wiesen wir bei diesen Mäusen eine erhöhte Ablagerung an Kollagenen verglichen mit Kontrolltieren nach. In vivo-Genexpressionsanalysen zeigten eine signifikant erhöhte Induktion der Kollagene Typ I und III, den häufigsten Kollagentypen der Dermis. Auf Proteinebene wurde zudem ein erhöhter Gehalt der Kollagen-spezifischen Aminosäure Hydroxyprolin nachgewiesen. Diese Resultate unterstützten die Hypothese der ECM-Reorganisation.
Im nächsten Schritt untersuchten wir an Fibroblasten (Fb) und gewebeständigen M2-Makrophagen (Mφ) in vitro eine konkrete Zellkommunikation, die für die Kollagenvermehrung in vivo ursächlich sein könnte. Beide Zellarten kommen in vivo in hoher Zahl in der ruhenden Dermis vor. Fb produzieren den Großteil der ECM, insb. Kollagene und andere fibrilläre Proteine. Aus der Literatur ist bekannt, dass gewebeständige Mφ sowohl mit HA als auch mit Fb komplex interagieren. Zudem sezernieren M2-Mφ zahlreiche profibrotische Zytokine und Wachstumsfaktoren (insb. TGF-β1), welche Einfluss auf den Differenzierungszustand und die Kollagensynthese bei Fb nehmen. Wir stellten die Hypothese auf, dass M2-Mφ im veränderten Microenvironment bei vermindertem HA die Fb hinsichtlich Differenzierungszustand und Matrixsynthese beeinflussen. Aufgrund verringerter Effektivität des Has2-KO im Arbeitsverlauf wurde das HA-Suppressionsmodell für die in vitro-Versuche umgestellt. Die HA-Suppression erfolgte nun mithilfe des etablierten 4- Methylumbelliferon (4MU), welches auf die Zellkulturen appliziert wurde. 4MU wirkt via Depletion eines HA-Vorläuferbausteins suffizient bei Fb. In eigenen Untersuchungen an Fb- und Mφ-Monokulturen in vitro verifizierten wir Effizienz, Reversibilität und Nicht-Toxizität der 4MU-Wirkung auf die Zellen unserer Population erfolgreich. Darauf aufbauend legten wir in vitro-Ko-Kulturen mit murinen Fb und M2-Mφ an. Der residente M2-Status der Mφ wurde durch vorherige IL-4-Applikation über mehrere Tage erreicht. 4MU-beeinflusste Ko-Kulturen wurden gegen nicht beeinflusste Ko-Kulturen verglichen. Zudem variierten wir die Kultivierungsdauer (48 h; 72 h) und das Zellzahlverhältnis der Ko-Kulturen: Eine Ko-Kulturkondition umfasste zehn Anteile Fb und einen Anteil Mφ (10:1-Ko-Kultur); die andere Kondition umfasste einen Anteil Fb und zehn Anteile Mφ (1:10-Ko-Kultur). Nach Ko-Kultivierung trennten wir Fb und Mφ mittels Magnetismus-basierter Separation anhand der CD11b-Oberflächenpräsentation in CD11b-positive Fraktion (murine Mφ) und CD11b-negative Fraktion (murine Fb). Die Reinheit der Separation wurde mittels Durchflusszytometrie verifiziert. Anschließend analysierten wir in Mφ die Expression von Genen, welche die Schlüsselkomponenten eines profibrotischen Signalwegs mit folgender Sekretion von TGF-β1 darstellen (Tlr2, Tlr4, Myd88, Tgfb1). Zudem wurde der bedeutendste HA-Transmembranrezeptor CD44 auf mRNA- und Zelloberflächenebene untersucht. Hinsichtlich der Fb analysierten wir die Genexpression der Kollagene Typ I und III (Col1a1, Col3a1), des fibrillären Matrixproteins ED-A-FN1, sowie verschiedener Gene, die mit dem verstärkten Ansprechen auf TGF-β1 korrelieren (Tgfb1, Tgfbr1, Ccn2, Cox2). Durch Genexpressionsanalyse des Myofibroblastenmarkers αSMA wurde ein möglicher Differenzierungsprozess der Fb durch Wirkung von TGF-β1 untersucht.
In Mφ- und Fb-Monokulturen, die als Kontrollen angelegt wurden, konnte im Wesentlichen keine signifikante Wirkung des 4MU auf die untersuchten Gene festgestellt werden. Mögliche Unterschiede auf mRNA-Ebene innerhalb ko-kultivierter Zellen wurden dadurch aussagekräftig. Durch Fb-Monokulturen, welche mit TGF-β1 im Überschuss versetzt wurden, verifizierten wir die Stimulierbarkeit unserer Fb-Population. Die genannten Gene sollten nach TGF-β1-Gabe in Fb vermehrt induziert werden; hier zeigten sich mehrheitlich adäquate Resultate. Wir konnten in Mφ aus 4MU-behandelten Ko-Kulturen eine tendenziell erhöhte Genexpression der Toll-like-Rezeptoren (Tlr2, Tlr4) sowie des Tlr-assoziierten Myd88 feststellen. Zudem wurde mithilfe einer durchflusszytometrischen Analyse gezeigt, dass Mφ nach 4MU-Applikation insgesamt weniger CD44 auf der Zelloberfläche präsentieren. Dies ist ein Indiz dafür, dass Mφ ihre extrazelluläre Umgebung wahrnehmen und ihre Rezeptorexpression ab-hängig vom HA-Gehalt verändern. In ko-kultivierten Fb wurde nach 4MU-Applikation eine signifikant verstärkte Genexpression der Kollagene Typ I und III gemessen; dieses Ergebnis war konkludent zu den erläuterten in vivo-Daten. Ebenfalls wurde bei Untersuchungen des Myofibroblastenmarkers αSMA sowie von Genen, die mit dem Ansprechen auf TGF-β1 korrelieren, eine höhere Geninduktion bei HA-supprimierter Kultur nachgewiesen. Diese Daten aus ko-kultivierten Fb liefern Hinweise dafür, dass nach HA-Suppression durch Anwesenheit von Mφ eine Zellkommunikation mit profibrotischem Effekt bei Fb ablaufen könnte.
Tendenziell schwache Unterschiede zwischen 4MU-behandelten und 4MU-unbehandelten Ko-Kulturen sind vor dem Hintergrund einer mäßigen 4MU-Wirkung zu sehen: Nach ELISA-Messung fiel die HA-Suppression in den Ko-Kulturen schwächer aus als in vorherigen Mono-kultur-Versuchen und Vergleichsstudien. Als Gründe für diese schwächere HA-Reduktion sind Interaktionen mit dem Medium und ko-kultivierenden Mφ zu vermuten – die 4MU-Wirkung auf Immunzellen und ko-kultivierende Zellen in vitro ist in der Literatur nur unzureichend untersucht. Zudem sind einige Sekundär-Effekte von 4MU bekannt, die sich auf die Proliferation der Fb, die Synthese und Aktivierung verschiedener ECM-Komponenten neben dem HA sowie auf den allgemeinen Zellmetabolismus auswirken. Diese Effekte könnten potenziell Einfluss auf unsere Resultate nehmen. Insgesamt konnten wir Hinweise dafür gewinnen, dass HA-Suppression direkte Folgen für den Umbau der ECM hat. Ebenfalls konnten wir Hinweise dafür sammeln, dass unter HA-Suppression eine profibrogene Zellkommunikation zwischen Mφ und Fb besteht. Diese Kommunikation resultierte bei Fb in erhöhter Transkription von Komponenten des TGF-β1-Signalwegs, von Kollagenen und Markern eines profibrotischen Differenzierungsstatus. Da sich diese erhöhten Genexpressionen zumeist erst nach 72 h zeigten, wäre eine Betrachtung der Ko-Kulturen mit längeren Kultivierungszeiten sinnvoll. Ebenso könnten eine Genexpressionsanalyse zusätzlicher profibrotischer Zytokine und Mediatoren, die von Mφ sezerniert werden (bspw. IL-6) sowie ein TGF-β1-ELISA aus Ko-Kultur-Überständen angeschlossen werden.
Die vorliegende Arbeit beschreibt neue Ergebnisse bezüglich des Forschungsfeldes zu vermindertem HA-Gehalt. Hinsichtlich des zuvor wenig charakterisierten Has2-KO-Modells konnte eine signifikante Vermehrung von Kollagenen bei HA-Suppression beschrieben wer-den. Ebenso wurde erstmals in vitro eine spezifische Rolle von vermindertem HA innerhalb der mannigfaltigen Beziehungen zwischen Fb und M2-Mφ untersucht. Hierbei konnten wir Indizien für einen Mφ-vermittelten Signalweg bei HA-Verminderung gewinnen. Diese Arbeit bildet somit eine Grundlage für sich anschließende in vivo- und in vitro-Studien zum Komplex der HA-Suppression in der Haut.:INHALTSVERZEICHNIS I
ABBILDUNGSVERZEICHNIS V
TABELLENVERZEICHNIS VII
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IX
1. EINLEITUNG 1
1.1. Funktion und Aufbau der menschlichen Haut 1
1.2. Zelluläre und Extrazelluläre Bestandteile der Dermis 3
1.2.1. Allgemeine Zelluläre Bestandteile 3
1.2.2. Myofibroblasten – Funktion und Charakterisierung 5
1.2.3. Extrazelluläre Matrix (ECM) 6
1.3. Hyaluronan als zentraler Bestandteil der ECM 8
1.3.1. Aufbau, biochemische Eigenschaften, Funktionen und Vorkommen 8
1.3.2. Metabolismus 10
1.3.3. Rezeptoren und Signalwege 11
1.4. Ziel der Dissertation 14
2. MATERIALIEN 17
2.1. Mausstämme 17
2.2. Puffer, Lösungen und Medien 17
2.3. Chemikalien, Enzyme und Reagenzien 18
2.4. DNA-Primer 20
2.5. Kits 21
2.6. Antikörper für Durchflusszytometrie 21
2.7. Geräte 22
2.8. Verbrauchsmaterialien 24
2.9. Software 25
3. METHODEN 27
3.1. Arbeiten am Tiermodell 27
3.2. Induzierbarer Has2-KO in Versuchstieren 27
3.2.1. Das Cre/loxP-System 27
3.2.2. Induktion des Has2-KO in vivo 29
3.3. In vitro-Versuche 30
3.3.1. Zellkulturen 30
3.3.2. Isolation muriner Fb und Kulturerhalt 30
3.3.3. Trypsinieren und definiertes Aussäen der Fb 31
3.3.4. Isolation muriner Mφ und Kulturerhalt 31
3.3.5. Durchführung der Ko-Kultur-Versuche 32
3.4. Molekularbiologische Untersuchungen 33
3.4.1. RNA-Isolation aus Zellkulturen 33
3.4.2. RNA-Isolation aus Hautgewebe 33
3.4.3. RNA-Konzentrationsbestimmung und Analyse der Reinheit 34
3.4.4. cDNA-Synthese durch reverse Transkription 34
3.4.5. Herstellung von Standard-Plasmiden für RT-PCR 35
3.4.6. Quantitative RT-PCR 37
3.4.7. HA-ELISA 39
3.4.8. Hydroxyprolin-Assay 40
3.5. Analyse spezifischer Zellpopulationen 41
3.5.1. Separation von CD11b-positiven Zellen aus Ko-Kulturen 41
3.5.2. Durchflusszytometrie 42
3.6. Histologische Analysen 44
3.6.1. Anfertigen von Paraffinschnitten sowie Entparaffinierung 44
3.6.2. Histochemische Masson-Trichrom-Färbung 45
3.7. Statistische Methoden 46
4. ERGEBNISSE 47
4.1. Histologische Analyse des Has2-KO-Phänotyps in ruhender Haut 47
4.2. mRNA-Analyse am Has2-KO-Modell in vivo 48
4.3. Proteinanalysen am Has2-KO-Modell in vivo 49
4.4. Umstellung der HA-Suppression auf 4MU-Modell 50
4.4.1. Pharmakologische Unterdrückung der HA-Synthese durch 4MU sowie
Evaluierung der Dosis 51
4.4.2. Untersuchungen zu Effizienz und Reversibilität der 4MU-Wirkung 52
4.4.2.1. Kultivierung muriner Fb mit 4MU über 96 h 53
4.4.2.2. Kultivierung muriner Fb mit 4MU über 15 Tage 54
4.4.2.3. Kultivierung von murinen Mφ mit 4MU 56
4.5. Fb-Mφ-Kokultur-Versuche 59
4.5.1. Etablierung des Ko-Kultur-Settings 59
4.5.2. HA-ELISA aus Ko-Kultur-Überständen 62
4.5.3. Genexpressionsanalysen in Mφ aus Ko-Kulturen 63
4.5.3.1. Analyse von Tlr2 63
4.5.3.2. Analyse von Tlr4 65
4.5.3.3. Analyse von Myd88 66
4.5.3.4. Analyse von Tgfb1 67
4.5.3.5. Analyse von Cd44 69
4.5.4. Genexpressionsanalysen in Fb aus Ko-Kulturen 71
4.5.4.1. Analyse von αSMA 71
4.5.4.2. Analyse von Col1a1 73
4.5.4.3. Analyse von Col3a1 75
4.5.4.4. Analyse von ED-A-FN1 76
4.5.4.5. Analyse von Tgfbr1 78
4.5.4.6. Analyse von Ccn2 79
4.5.4.7. Analyse von Cox2 81
4.5.4.8. Analyse von Tgfb1 82
4.5.5. Zusammenfassung der Genexpressionsanalysen aus Ko-Kulturen 84
4.5.6. Durchflusszytometrische Untersuchungen 85
4.5.6.1. Evaluierung der Reinheit von Fb- und Mφ-Separation 85
4.5.6.2. Analyse von CD44 auf der Zellmembran von Mφ 86
5. DISKUSSION 89
5.1. Grundlage der Arbeitsidee 89
5.2. Betrachtung der in vivo-Ergebnisse (Has2-KO) 90
5.3. Effizienz und Einflüsse der verwendeten HA-Suppressionsmodelle 94
5.4. Betrachtung der in vitro-Ergebnisse (4MU-Applikation) 97
5.5. Fazit und Ausblick auf zusätzliche in vitro-Untersuchungen 106
6. ZUSAMMENFASSUNG 109
LITERATURVERZEICHNIS 115
ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGE ABFASSUNG DER ARBEIT i
ANERKENNUNG DER PROMOTIONSORDNUNG iii
LEBENSLAUF v
DANKSAGUNG vii
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:91549 |
| Date | 21 May 2024 |
| Creators | Förster, Felix |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/acceptedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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