På grund av planerat tillverkningsstopp av instrumenten som används idag på Octapharma AB, så syftar detta projekt till nyutvecklingen av en kvantitativ PCR analysmetod för detektion av HIV-1 i human blodplasma, genom TaqMankemi. Projektet inkluderade design, testning och utvärdering av olika set av primer och probe sekvenser. För att säkerställa specificiteten hos metoden designades primrarna och proberna för att vara komplementära till olika konservativa regioner av HIV-1:s genom. Primer och probe set:en (P/P) testades både individuellt och kombinerat i spädningsserier och genotypspaneler. Analyserna visade att det inte fanns någon korrelation mellan felmatchning av P/P och referenssekvenser hos subtyper, och detektionsnivå. När P/P testades i kombination hittades falsk-positiva signaler i negativa kontroller (4 falsk-positiva signaler; n= 106). Detta åtgärdades genom att utesluta specifika prober(0 falsk-positiva signaler; n= 152)(p = 0,030, Fisher’s exact test). Kombinationen av primer och prober, med någraprober uteslutna, hade en högre detektionsnivå för HIV-1 subtyper än de individuella set:en (29 positiva prover vs 23.5; n= 64), och lyckadesäven detektera åtminstone ett positivt prov hos varje subtyp A, B, C, D, AE, F, G och H. Avsaknaden av korrelation mellan felmatchning av P/P och detektionsnivå, visar på att orsaken av den suboptimala detektionsnivån av subtyper var inte på grund av antalet felmatchningar mellan primer och probe set:en till målsekvenserna. Den högre specificiteten vid kombination av P/P indikerar även att primrar och prober som riktar in sig på olika regioner avHIV-1 genomet ytterligare ökar specificiteten och detektionsnivån hos metoden. / As a result of future instrument discontinuation by Octapharma AB’s manufacturers, this project sought to develop a new quantitative PCR analysis method for the detection of HIV-1 in human blood plasma using TaqMan chemistry. The project included the design, testing and statistical analysis of different sets of novel primer and probe sequences. To ensure specificity, the primer and probe sequences were designed to target conserved regions of the HIV-1 genome. The primer and probe sets were tested both individually and in combination in dilution series and genotype tests. Linear regression analyses showed no correlation between mismatches between the primer and probe sets and the subtype reference sequences tested, and detection rate. When the primer and probe setswere tested in combination, false positive signals were obtained in negative control samples (4 false positive signals; n= 106). However, this obstacle was overcome by the omission of certain probes, resulting in no false positive signals (0 false positive signals; n= 152)(p = 0.030, Fisher’s exact test).The combination of primer and probe sets, with certain probes omitted, had an increased HIV-1 subtype detection rate compared to the individual P/P (29 positive samples detected versus 23.5; n= 64), and were also able to detect at least one positive sample from each of the HIV-1 subtypes A, B, C, D, AE, F, G, and H. The absence of correlation between primer and probe set mismatch and detection rate, suggests that the cause of the suboptimal detection rate of the subtypes was not the result of primer and probe set mismatch to the target sequences. The increased subtype detection rate upon combining the P/P also indicates that targeting different region of the HIV-1 genome further improves the detection rate and specificity of the method.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:kth-299883 |
| Date | January 2021 |
| Creators | Schöldström Degenne, Jacob |
| Publisher | KTH, Proteinvetenskap |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | TRITA-CBH-GRU ; 2021:155 |
Page generated in 0.003 seconds