Vários laboratórios descreveram moléculas que estão envolvidas na invasão do Trypanosoma cruzi à célula hospedeira. Nosso laboratório foi o primeiro a descrever moléculas de 85 kDa pertencentes a uma família de glicoproteínas (Tc-85) que possuem graus diferentes de homologia de seqüência com os membros da superfamília das gp85/transialidases. Um componente acídico (Tc85-11) da família Tc-85 que se liga à laminina e a receptores da célula hospedeira foi clonado e expresso (Giordano et al., JBC 274, 3461,1999). Nós levantamos a hipótese de que o polimorfismo dos diferentes membros da família Tc-85 poderiam determinar diferentes propriedades da adesão à célula hospedeira. Para provar tal hipótese, uma biblioteca genômica de Tc-85 utilizando o vetor pTEX e os seguintes primers: R-1 (5\') ATGTCCCGGCGTGTGTTTACTTCC e GPI-2(3\') TCACAAAGTCGCAAAGCCCCACAGTCC, foi digerida com enzimas de restrição resultando em fragmentos de tamanho esperado (~2-2,5 kb) em 91% dos clones selecionados. Treze clones foram seqüenciados em suas extremidades 5\' e 3\'. Nenhum era idêntico entre si apesar da variabilidade da homologia de seqüência (40-70%). No entanto, quando comparadas as regiões codantes para o peptídeo sinal foi encontrada uma homologia de 90%. Para assegurar a clonagem de genes funcionais, uma biblioteca de cDNA foi construída com primers degenerados (5\'-ATTTTTGTTCCGCAGAAGACGCAGGTG, 3\'ATTCAGTGGGCGGTTGTACAGAAAGAC) por transcrição reversa de seqüências conservadas da superfamília das gp85/transialidases, excluindo a seqüência codante para o peptídeo sinal e a seqüência codante para âncora de GPI (presença de aminoácidos hidrofóbicos). Os cDNAs foram amplificados e clonados no vetor de expressão pCR®T7/NT-TOPO. Foram selecionados 60 clones que foram submetidos à análise de restrição e 90% deles mostraram fragmentos com tamanho esperado. As proteínas de fusão de 4 destes clones foram reconhecidas em Western blot por um anticorpo policlonal feito contra um fragmento da Tc85-11 (H3.3). As seqüências obtidas da extremidade 5\' revelou que os quatro clones pertencem à superfamília das gp85/transialidase (GenBank). O alinhamento destas seqüências com a Tc85-11 mostrou uma homologia de 60-80% e uma identidade de 40-70% na seqüência de aminoácidos. Estes dados confirmam a heterogeneidade da família da Tc-85 que é expressa pelo parasita. Ademais, a expressão de elevadas quantidades das proteínas correspondentes permitirá a identificação dos ligantes respectivos para estas proteínas de superfície específicas de tripomastigotas. / Several laboratories described molecules that are involved in Trypanosoma cruzi invasion of host-cells. Our laboratory was the first to describe molecules of 85 kDa belonging to a glycoprotein family (Tc-85) having different degrees of sequence homology with the members of the gp85/trans-sialidase supergene family. An acidic component (Tc85-11) of the Tc-85 family that binds to laminin and to host-cell receptors was cloned and expressed (Giordano et al., JBC 274, 3461, 1999). We raised the hypothesis that the polymorphism of different members of the Tc-85 family could specify different adhesion properties to host proteins. In order to prove the hypothesis, a genomic Iibrary of Tc-85 using the pTEX vector and primers R-1 (5\') ATGTCCCGGCGTGTGTTTACTTCC and GPI-2 (3\') TCACAAAGTCGCAAAGCCCCACAGTCC was cut with restriction enzymes resulting in fragments of the expected size (~2-2.5 kb) in 91% of the clones. Thirteen clones were sequenced from their 5\' and 3\' terminal ends. None were identical in spite of a variable sequence homology (40-70%), as opposed to 90% of homology when the signal peptide coding regions were compared. In order to assure the cloning of functional genes, a cDNA Iibrary was constructed with degenerated primers ((5\') ATTTTTGTTCCGCAGAAGACGCAGGTG / (3\') ATTCAGTGGGCGGTTGTACAGAAAGAC) for reverse transcription of conserved sequences from the gp85/trans-sialidase supergene family excluding the hydrophobic sequences from both extremities. The cDNAs were amplified by PCR and cloned into pCR ®T7/NT-TOPO expression vector. 60 clones were selected and were subjected to restriction analysis and 90% of the clones showed fragments with the expected size. The expressed fusion proteins of 4 of these clones were recognized in Western blots by a polyclonal antibody raised against a fragment of Tc85-11 (H3.3). The sequences obtained from the 5\' termini revealed that all four clones belong to the gp85/trans-sialidase supergene family (GenBank TM). The alignment of these sequences with Tc85-11 showed a homology of 60-80% and an identity of 40-70% in aminoacid sequence. These data confirm the heterogeneity of the Tc-85 family that is expressed by the parasite. Additionally, the expression of high amounts of the corresponding proteins will allow the identification of putative Iigands for these trypomastigote specific surface proteins.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-11112014-144008 |
| Date | 23 November 2000 |
| Creators | Débora Rose de Oliveira |
| Contributors | Maria Julia Manso Alves, Pio Colepicolo Neto, Armando Morais Ventura |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Biológicas (Bioquímica), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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