A Ordem Diptera é constituída de milhares de espécies, cujo tempo de divergência pode chegar a 250 milhões de anos entre representantes das Sub-Ordens Brachycera e Nematocera. Esta janela temporal, no entanto, não é suficiente para explicar o aparecimento de estruturas cromossômicas terminais alternativas aos telômeros canônicos, conservados desde eucariontes unicelulares até mamíferos. Alguns autores admitem que estruturas não canônicas tenham sido geradas e selecionadas a partir de eventos mutacionais que resultaram na perda da telomerase em espécies ancestrais. Especulações deste tipo, embora pertinentes, não levam em conta que o número de espécies de dípteros estudados até aqui quanto a telômeros e sub-telômeros está longe de representar a diversidade na Ordem. Como evidência negativa não constitui prova, a possível existência de dípteros dotados de telômeros canônicos não pode ser descartada. Também neste sentido, a possível ocorrência de retrotransposons especificamente terminais, como vistos em Drosophila, em espécies ainda não estudadas pode ser vista como possibilidade em aberto apesar da evidência negativa documentada no presente trabalho em R. Americana e em T. pubescens. Outra idéia que tem ganhado corpo com dados procedentes de telômeros não canônicos refere-se à possibilidade de que um organismo apresente mais de uma sequência de DNA terminal. Pouco comentada, esta noção teve início em meados da década de 1980 quando foram publicados os primeiros trabalhos sobre o DNA telomérico de espécies da família Chironomidae. O aparecimento destes dados na literatura praticamente coincidiu com a publicação da descoberta da telomerase. Mais tarde, estudos em Drosophila têm mostrado que três retrotransposons com sequências diferentes podem compor o DNA telomérico nesta espécie. Além disto, repetições aparentemente terminais em Anopheles hibridam em um único telômero, sugerindo que sequências desconhecidas estejam presentes em outros telômeros. Dados obtidos neste trabalho mostram em R. Americana uma nova repetição em tandem que apresenta características de sequência telomérica, a exemplo de duas outras caracterizadas com antecedência nesta espécie. Assim, R. Americana poderia ser vista como exemplo adicional de organismo dotado de mais de uma sequência de DNA terminal. No final da presente exploração, não foi possível a identificação de sequências comuns às extremidades cromossômicas de T. pubescens. Os resultados obtidos sugerem que esta espécie apresenta uma estrutura cromossômica terminal distinta se comparada àquelas de dípteros estudados até então. Uma das hipóteses levantadas a partir dos resultados observados é a de que sequências teloméricas estão presentes em todas as extremidades cromossômicas de T. pubescens; o problema estaria na impossibilidade de visualizá-las através de hibridação in situ em função do comprimento do DNA telomérico que estaria abaixo do limite da técnica de detecção. Isto implicaria deixar de lado os métodos usualmente empregados pelo laboratório na busca de DNA repetitivo terminal. Caso esta espécie apresentasse repetições terminais curtas como aquelas caracterizadas em R. Americana, uma das alternativas seria a de sequênciar massivamente clones obtidos por microdissecção e DOP-PCR até encontrarmos sequências com estas características. Em seguida, o ensaio com Bal-31 seria decisivo na determinação da posição cromossômica das mesmas. Finalmente, os dados sintetizados nos três capítulos deste trabalho reforçam a afirmação de que a Ordem Diptera é uma fornte privilegiada de diversidade quanto a estruturas cromossômicas terminais. Apesar das dificuldades inerentes à exploração de organismos não modelares, a continuidade dos estudos sobre telômeros e sub-telômeros nestas espécies certamente ampliará o conhecimento sobre alternativas de manutenção da integridade cromossômica a partir de suas extremidades / The vast majority of eukaryotic organisms have short tandem repeats and telomerase as components of telomeric structures. However, in dipteran species, this structural conservation is not found. While in Drosophila telomeres are composed of specific retrotransposons, complex tandem repeats are found in the genus Anopheles and in species of Chironomus. In Rhynchosciara americana (family Sciaridae), short repetitions (16 and 22 base pairs) arranged in tandem are observed at chromosome terminal regions. Moreover, in situ hybridization using RNA probes suggests that a third repetition enriched with homopolymeric (dA)/(dT) could occupy significant portions of this chromosomal region in R. americana. In addition, a retroelement named \"RaTART\" was described at chromosomal ends of R. americana; this element enables telomeric maintenance by retrotransposon action in basal dipterans. In this thesis, we present results that rule out the possibility that the \"RaTART\" element occupies the chromosome terminal structure in R. americana. Additional analyses were performed with the sequence RaTART from GenBank and primers designed for the amplification of significant portions of the regions 5′UTR, 3′UTR, and the coding region for reverse transcriptase (RT) of this retroelement. The sequencing and in situ hybridization of these three fragments obtained after PCR (5′UTR, 3′UTR, and RT) indicate that the retroelement RaTART corresponds to a chimeric genomic clone, consisting of distinct repetitive elements, of which only one might be present at the apparent enrichedment terminal. In the second phase of this thesis, we describe a method for the isolation and characterization of the homopolymeric (dA)/(dT) sequence described in the chromosome terminal regions of R. americana. Named T-14, this sequence shares some similarity with canonical telomeric repeats, suggesting that R. americana represents an additional example of an organism where more than one DNA sequence may extend toward the chromosome terminal regions. Finally, we present the results of heterologous hybridization to elucidate structural aspects of conservation and/or divergence in Sciaridae terminal heterochromatin. Three species of the family Sciaridae were assessed by in situ hybridization of polytene chromosomes: R. americana, Rhynchosciara milleri, and Trichosia pubescens. The DNA probe used was obtained by microdissection of non-centromeric chromosome ends from R. americana and T. pubescens, followed by amplification and labeling by degenerate oligonucleotide primed (DOP-PCR). When each probe was hybridized to own chromosome complement, two patterns were observed: (i) hybridization at all non-centromeric ends (R. americana), and most surprisingly, (ii) hybridization only at the end that gave the product of microdissection (T. pubescens). Probes obtained from R. americana produced no hybridization signals on chromosomes of T. pubescens and R. milleri. Unexpected results were obtained when the probe obtained from T. pubescens was hybridized with chromosomes of R. americana and R. milleri. Surprisingly, this probe, which scored only one end in its own chromosome complement, generated hybridization signals in all non-centromeric chromosomal ends of R. americana, as well as in its pericentromeric-centromeric heterochromatin. In R. milleri, the probe from T. pubescens clearly hybridized with centromere-associated heterochromatin of its chromosome C. The data obtained in this study support a process of chromosomal divergence between these three species of Sciaridae occurred by differential amplification of sequences of heterochromatin components, and point to an unusual structure in T. pubescens compared to other dipterans studied for terminal chromosome structure
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-10012013-150232 |
| Date | 11 May 2012 |
| Creators | Fernandes, Thiago |
| Contributors | Gorab, Eduardo |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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