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Previous issue date: 2017-02-22 / FACEPE / A ampla utilização das sementes de Moringa oleifera no tratamento de água torna necessários estudos para determinação da segurança do uso para a população. As sementes de M. oleifera contêm lectinas (proteínas hemaglutinantes que ligam carboidratos). Dentre elas, há a lectina WSMoL (do inglês water-soluble M. oleifera lectin), que é um dos agentes responsáveis pelas propriedades coagulantes e que possui atividade larvicida contra Aedes aegypti. Os objetivos deste trabalho foram: (1) determinar a toxicidade do extrato de sementes sobre células humanas normais GN1 (linhagem celular não-tumorigênica derivada de fibroblastos) e HaCaT (linhagem não-tumorigênica derivada de queratinócitos humanos); (2) avaliar a cinética de coagulação promovida por WSMoL em modelo de água turva utilizando caolin, através de medidas de densidade óptica e variação de resistência elétrica, na ausência e presença de carboidratos e íons; (3) investigar o efeito de WSMoL na sobrevivência e atividade de enzimas digestivas de larvas de Culex quinquefasciatus, mosquito vetor da filariose e chikungunya. O extrato aquoso de sementes de M. oleifera reduziu o número de células viáveis com CE50 (48 h) de 1,32 e 1,23 μg/mL de proteínas para HaCaT e GN1, respectivamente. A análise por citometria de fluxo revelou que o extrato induziu a morte de GN1 por necrose enquanto que as células HaCaT não apresentaram marcação para necrose ou apoptose. A avaliação da expressão do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) revelou uma redução de 45,4±1,3% em células HaCaT tratadas, confirmando um efeito antiproliferativo. O tratamento de GN1 e HaCaT com o extrato aumentou os níveis mitocondrial e citosólico de espécies reativas de oxigênio, bem como causou uma diminuição do consumo de O2. A detecção de toxicidade do extrato de sementes sobre células humanas normais indica cautela em relação à dosagem utilizada para o tratamento da água. WSMoL apresenta massa molecular nativa de 60 kDa e ponto isoelétrico 5,5. Em SDS-PAGE, foram observados três bandas polipeptídicas com aproximadamente 30, 20 e 10 kDa. Foi detectada redução tanto da densidade óptica quanto da resistência elétrica na suspensão de caolin tratada com WSMoL, o que indica que a atividade coagulante se deve à desestabilização das partículas em suspensão, seguida por interações químicas entre as partículas e a lectina. A incubação da lectina com os monossacarídeos N-acetilglicosamina, glicose e frutose (em concentrações que inibiram a atividade hemaglutinante) ou com íons cálcio e magnésio promoveram a redução da atividade coagulante de WSMoL. Esses resultados sugerem que grupos presentes no domínio de ligação a carboidratos podem estar envolvidos na atividade coagulante de WSMoL, bem como que a conformação da lectina necessária para essa propriedade é afetada pela ligação de carboidratos e íons. WSMoL revelou-se larvicida sobre C. quinquefasciatus com CL50 de 1,05 mg/mL. A incubação de extratos do intestino das larvas com a lectina não afetou a atividade de α-amilase e tripsina, porém reduziu significativamente a ação catalítica de protease, sugerindo que a atividade larvicida pode-se estar ligada à interferência no processo de digestão e absorção de nutrientes. / The wide use of Moringa oleifera seeds in the treatment of water makes studies necessary to determine the safety for the population. The seeds of M. oleifera contain lectins (hemagglutinating proteins that bind carbohydrates). Among them, there is the WSMoL (water-soluble M. oleifera lectin), which is one of the agents responsible for the coagulant properties and that has larvicidal activity against Aedes aegypti. The aims of this work were: (1) to determine the toxicity of the seed extract on normal human cells GN1 (non-tumorigenic cell line derived from fibroblasts) and HaCaT (non-tumorigenic line derived from human keratinocytes); (2) to evaluate the kinetics of coagulation promoted by WSMoL in turbid water model using kaolin, through measurements of optical density and of electrical resistance variation, in the absence and presence of carbohydrates and ions; (3) to investigate the effect of WSMoL on the survival and activity of digestive enzymes of Culex quinquefasciatus larvae, vector mosquito of filariasis and chikungunya. The aqueous extract of M. oleifera seeds reduced the number of viable cells with EC50 (48 h) of 1.32 and 1.23 μg/mL of proteins for HaCaT and GN1, respectively. Flow cytometry analysis revealed that the extract induced the death of GN1 by necrosis while HaCaT cells showed no labeling for necrosis or apoptosis. Evaluation of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression revealed a 45.4±1.3% reduction in treated HaCaT cells, confirming an antiproliferative effect. The treatment of GN1 and HaCaT with extract increased the mitochondrial and cytosolic levels of reactive oxygen species, as well as a decrease in O2 consumption. The detection of toxicity of the seed extract on normal human cells indicates caution regarding the dosage used for the treatment of water. WSMoL has a native molecular mass of 60 kDa and isoelectric point 5.5. In SDS-PAGE, three polypeptide bands with approximately 30, 20 and 10 kDa were observed. Reduction of both the optical density and the electrical resistance were detected in the kaolin suspension treated with WSMoL, indicating that the coagulant activity is due to the destabilization of the suspended particles, followed by chemical interactions between the particles and the lectin. Incubation of the lectin with the monosaccharides N-acetylglucosamine, glucose and fructose (at concentrations that inhibited hemagglutinating activity) or with calcium and magnesium ions promoted the reduction of the coagulant activity of WSMoL. These results suggest that groups present in the carbohydrate binding domain may be involved in the coagulant activity of WSMoL, as well as that the conformation of the lectin required for this property is affected by the binding of carbohydrates and ions. WSMoL showed to be larvicidal on C. quinquefasciatus with LC50 of 1.05 mg/mL. Incubation of larval intestinal extracts with lectin did not affect α-amylase and trypsin activity, but significantly reduced the catalytic action of protease, suggesting that larvicidal activity may be linked to interference in the digestion and absorption of nutrients.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/24263 |
| Date | 22 February 2017 |
| Creators | MOURA, Kézia Santana de |
| Contributors | http://lattes.cnpq.br/2885145995086459, PAIVA, Patrícia Maria Guedes, VERCESI, Aníbal Eugênio |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco, Programa de Pos Graduacao em Bioquimica e Fisiologia, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Breton |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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