Lasergestützte Mikromanipulation an der Kanincheneizelle im Rahmen von Kerntransferexperimenten Bohn, Dirk Aus der Ambulatorischen und Geburtshilflichen Tierklinik der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig und dem Institut für Tierzucht und Tierhaltung mit Tierklinik der Landwirtschaftlichen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Juni, 2001 120 S., 199 Lit., 38 Tab., 20 Abb.; Anhang 15 S.: 8 Abb., 15 Tab. Mit der vorliegenden Arbeit sollten erstmalig die Methoden der Laser-vermittelten, berührungsfreien Öffnung der Zona pellucida (Laser-Zona-Drilling, LZD) und der funktionellen Deaktivierung der Vorkerne als einfachere und die Entwicklungsfähigkeit behandelter Zellen weniger beeinträchtigende Methoden im Vergleich zu herkömmlichen mechanischen Methoden des Kerntransfers experimentell bearbeitet werden. Für den Einsatz des Lasers sind grundlegende Kenntnisse über die Wirkungsweise der fokussierten Laserstrahlen am Zielobjekt der Mikromanipulation, den Kanincheneizellen, notwendig. Deshalb wurden zunächst sehr umfangreiche Untersuchungen zum Einfluß steigender Einwirkzeiten des Lasers bei Verwendung drei verschiedener Objektive an und in befruchteten Eizellen in vitro und in vivo durchgeführt. Hierfür kamen 863 Eizellen in 11 verschiedenen Methoden (M) zum Einsatz. Mit den Methoden 1-3 (231 Eizellen) wurde der Einfluß der Objektive beim LZD in vitro untersucht. In den Methoden 4 und 5 kam der Embryotransfer nach LZD zur Anwendung (202 Embryonen). Die Methoden 6-8 (202 Eizellen) wurden zum Einfluß der drei Objektive bei der direkten Laserfokus-vermittelten Manipulation der lichtmikroskopisch sichtbaren Vorkerne in vitro durchgeführt. Bei den Methoden 9-11 (228 Eizellen) wurde der Laserfokus (gleiches Objektiv) in seiner Lage zu den Vorkernen verändert (defokussiert), um zur Wirkungsweise der fokussierten Laserstrahlen in der Eizelle Aussagen zu ermöglichen. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurden 3 Kerntransfergruppen (G) nach definierter Methodik gebildet, wobei zur Vergleichbarkeit die Parameter der Lasereinstellung (maximale Pulsfrequenz und Energie) von den methodischen Untersuchungen übernommen wurden. Die Empfängereizellen (Vorkerne) der ersten beiden Gruppen (G1: 117; G2: 129) wurden einheitlich mit 10 Sekunden manipuliert. Der Unterschied bestand in der Blastomeren-gewinnung (G1: nach LZD; G2: enzymatisch). Die Empfängereizellen der Gruppe 3 (134) wurden lediglich mit 2 Sekunden manipuliert (enzymatische Blastomerengewinnung) fusioniert. Nachdem die Kerntransferembryonen der Gruppe 3 in vitro die beste Entwicklungsfähigkeit zeigten, wurden 112 so erstellte Kerntransferprodukte auf 8 pseudogravide Ammentiere übertragen. Bei den Untersuchungen zum LZD (M1-M3) und zur direkten Vorkernbearbeitung (M6- M8) zeigte sich eine Abhängigkeit vom verwendeten Objektiv dahingehend, daß die Verwendung des Achroplan den größten und des Neofluar den geringsten depressiven Einfluß auf die Entwicklungsfähigkeit behandelter Eizellen hat. Das Ultrafluar-Objektiv ist dem Neofluar-Objektiv sehr ähnlich. Mit Hilfe des Embryotransfers (202 Embryonen) nach LZD (M4 u. M5) konnte die Entwicklungspotenz dieser Embryonen in vivo (45 Nachkommen) gezeigt werden, wobei die Geburtsrate der übertragenen 2-Zeller (27,55 %) (M5) den 1-Zellern (17,31 %) (M4) signifikant überlegen ist. Mit den Methoden 9-11 wurde nachgewiesen, daß im Strahlkegel, in unmittelbarer Nähe zum Laserfokus, die depressive Beeinflussung vergleichbar zur direkten Vorkernmanipulation ist. Der mit steigender Einwirkzeit kontinuierlich sinkenden Entwicklungsfähigkeit bei Laserfokuspositionierung unter der Zelle (M10) steht eine mit kurzen Einwirkzeiten bessere, jedoch mit steigender Einwirkzeit sprunghaft schlechter werdende Entwicklungsfähigkeit bei Laserfokuspositionierung neben den Vorkernen in der Zelle (M11) gegenüber. Bei den Kerntransferexperimenten konnten die Totalausfälle durch Verzicht auf die mechanische Entkernung mit der damit verbundenen Verringerung der Anzahl an Empfängereizellen vermieden werden (nahezu identisches Ausgangsmaterial). Da kein Zytoplasma abgesaugt wurde, bestand ein hoher Anpressdruck auf die sich berührenden Fusionsmembranen von Oozyte und Blastomere, wodurch sich die sehr hohen Fusionsraten im Einzelschritt (G1: 75,2 %; G2: 86,8 %; G3: 97,7 %) erklären lassen. Die signifikant geringere Fusionsrate der Gruppe 1 ist wie die signifikant geringere Teilungsrate (G1:73,9 % versus G2: 92,0 % bzw. G3: 95,2%) auf die Blastomerengewinnung nach LZD zurückzuführen. Die Entwicklungsfähigkeit der Kerntransferembryonen in vitro der Gruppen 1 und 2 ist mit 3,1 % (G1) bzw. 1,9 % (G2) zum 32-Zeller als maximal erreichtes Entwicklungsstadium sehr schlecht. Nach Verringerung der Lasereinwirkzeit auf 2 Sekunden (G3) konnten die Kerntransferembryonen, als erster Erfolg der neuen Methode, mit 40,0 % in vitro das Morulastadium erreichen. Allerdings blieb nach Transfer so erstellter 112 Kerntransferembryonen auf pseudogravide Ammentiere die Geburt von Jungtieren aus. Durch die Verringerung der Pulsfrequenz und Laserenergie in Verbindung mit der gezielten Bearbeitung des gesamten Raumes der Vorkerne sollte eine vollständige Deaktivierung der Vorkerne bei größtmöglicher Schonung des Zytoplasmas möglich sein. Nach Ermittlung dieser Parameter sollten sie zur Entkernung von Metaphase-II-Oozyten verwendet werden. / Laser-microbeam-delivered micromanipulation during nuclear transfer experiments in rabbit oocytes Bohn, Dirk From the Large Animal Clinic for Theriogenology and Ambulatory Services Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig and the Institute of Animal Breeding and Husbandry with Veterinary Clinic of the Martin-Luther-University, Halle-Wittenberg June, 2001 120 p., 199 ref., 38 tab., 20 fig.; Annex 15 p.: 8 fig., 15 tab. The object of this work was to establish the first time the methods of Laser-microbeam-delivered non-touched opening of the Zona pellucida (known as Laser-Zona-Drilling, LZD) and the functional enucleation of the pronucleus. This methods are efficient and provide a good developmental capability of manipulated cells in comparison to previous used mechanical nuclear transfer methods. The basis for utilising Laser is to know about the effects of the focused laser-microbeam on targeted micromanipulated rabbit oocytes. Therefore, we next analysed in a number of in vivo and in vitro studies the time-dependent influence of laser in three different objectives of the device on or in fertilised oocytes. For this purpose about 863 oocytes in eleven different methods were used. In groups 1-3 (containing 231 oocytes) it was measured in vitro the influence of the objective during LZD, whereas in group 4 and 5 embryo transfer (202 embryos) after LZD was undertaken. In further in vitro studies (group 6-8, 202 oocytes), we were interested on the effects of three objectives on light-microscopic visible pronuclei which were directly manipulated with the laser-focus. Lastly, to follow the different application modus of the laser-focus (groups 9-11, 228 oocytes) the position of the laser-microbeam to the oocytes pronuclei was changed. Based up on these results three defined nuclear transfer groups (G) were built to compare the data of the first methodological validation with unchanged laser parameters (pulse repetition rate, laser energy). Recipient oocytes (pronuclei) of the first two groups (G1: 117; G2: 129) were manipulated with same time-duration of 10 seconds. The difference between both groups were in the isolation of blastomeres which was performed after LZD (G1) or enzymatic (G2). Recipient oocytes of group 3 (134) were merely treated with time-duration of 2 seconds and fused with enzymatic dissociated blastomeres. The nuclear transferred embryos in group 3 have shown the best developmental capability.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:10938 |
| Date | 27 November 2002 |
| Creators | Bohn, Dirk |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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