Bei der Altersabhängigen Makuladegeneration (AMD) handelt es sich um eine Erkrankung des Auges, die die Macula lutea, die Stelle des schärfsten Sehens betrifft. Sie ist verbunden mit der Degeneration von RPE-Zellen, die zur Dystrophie von Photorezeptoren und damit zum Verlust des zentralen Sehvermögens führt. Eine ähnliche Pathophysiologie ist bei der sogenannten Retinalen Pigmentepitheldystrophie (RPED) des Hundes zu beobachten. Die Transplantation von gesunden RPE-Zellen in das betroffene Gebiet stellt eine vielversprechende Therapiemöglichkeit dar. Die Transplantatabstoßung als Kom-plikation schränkt die klinische Anwendung ein. Eine beim Patienten nach Transplantation lebenslang durchgeführte systemische Immunsuppression ist mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden. Deshalb bietet die Gentherapie unter Einbezug immunsuppressiver Zytokine wie beispielsweise des Interleukin-10 (IL-10) eine Lösung. In der vorliegenden Arbeit wurde ein selbst konstruierter IL-10-Expressionsvektor (Plasmid pCIneoIL-10) mittels Gentransfer in humane RPE-Zellen in vitro eingebracht. Untersucht wurde die Wirkung des sezernierten IL-10 auf die Proliferation von allogenen T-Lymphozyten mit und ohne allogene Makrophagen als professionelle antigenpräsentierende Zellen (APC). Neben humanen Spender RPE-Zellen (Spender-hRPE-Zellen) wurde eine immortalisierte Permanent-Zelllinie (hTERT-RPE1-Zellen) eingesetzt, deren Hauptvorteil in einer gleichbleibend hohen Wachstumsrate lag. Als transientes Transfektions-system für den Transfer von IL-10-DNA in hRPE-Zellen wurden kationische Lipide gewählt. Drei verschiedene Lipidformulierungen wurden miteinander verglichen und das optimale Transfektionsreagenz:DNA-Verhältnis, mit dem die höchste Transfektionseffizienz erreicht werden konnte, evaluiert. Eine Transfektionseffizienz von 23,3 ± 9,0 % (hTERT-RPE1-Zellen) beziehungsweise 10,3 ± 4,5 % (Spender-hRPE-Zellen) konnte erreicht werden. Die Transfektion hatte weder einen negativen Einfluss auf die Vitalität der hRPE-Zellen, noch wurde der natürliche Zelltod, die Apoptose, erhöht. Die IL-10-mRNA-Expression wurde mittels RT-PCR nachgewiesen. Lediglich bei den transfizierten hRPE-Zellen konnte IL-10-mRNA gefunden werden. Mittels ELISA konnte das IL-10-Protein gemessen werden. Die Sekretion des IL-10 in den Kulturüberstand von transfizierten hRPE-Zellen wurde dafür über einen Zeitraum von 7 Tagen untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass die maximale IL-10-Proteinkonzentration bei beiden Zelllinien am Tag 3 mit Werten von 10,3 ± 0,8 ng/ml (hTERT-RPE1-Zellen) und 3,1 ng/ml (Spender-hRPE-Zellen) lag. Es bestand überdies eine positive Korrelation zwischen Transfektionseffizienz und synthetisiertem IL-10. Es wurde außerdem gezeigt, dass durch Stimulation mit dem immunmodulatorischen Zytokin Interferon-gamma (IFN-g) hRPE-Zellen MHC Klasse II-Moleküle vermehrt exprimierten. Damit sind sie ebenso wie die Makrophagen zur Antigenpräsentation fähig. Die Wirkung des von den transfizierten hRPE-Zellen sezernierten IL-10 auf die Proliferation von T-Lymphozyten wurde zwischen Tag 2 und Tag 6 (hTERT-RPE1-Zellen) beziehungsweise zwischen Tag 2 und Tag 4 (Spender-hRPE-Zellen) photometrisch untersucht. Die Proliferation allogener T-Lymphozyten mit beziehungsweise ohne Makrophagen konnte durch das sezernierte IL-10 supprimiert werden. Bei den hTERT-RPE1-Zellen lag ohne die Anwesenheit von professionellen APC am Tag 6 eine signifikante Reduktion der T-Lymphozytenproliferation vor, während bei Kokultivierung mit Makrophagen Signifikanzen am Tag 5 und Tag 6 erkennbar waren. Die immunsuppressive Wirkung von IL-10 konnte mittels Anti-IL-10-Antikörper neutralisiert werden. Damit wurde bewiesen, dass die proliferations-supprimierende Wirkung auf IL-10 zurückzuführen war. Diese Ergebnisse könnten demnach neue Möglichkeiten zur Verhinderung einer Abstoßungsreaktion nach RPE-Zelltransplantation bei Patienten mit AMD eröffnen / Age-related macular degeneration (AMD) is a disease of eyes affecting the macula lutea, the area of the retina with the highest density of retinal pigment epithelial cells (RPE cells). The disease is characterized by degeneration of RPE cells resulting in dystrophy of photoreceptors and finally loss of central vision. Transplantation of healthy RPE cells is a promising possibility for therapy but rejection of the allotransplant limits clinical application. One way to avoid this complications is a systemic immunosuppression of the recipient but this is combined with many side effects. In this thesis a self-constructed IL-10 expression vector (plasmid pCIneoIL-10) has been transferred into human RPE cells in vitro by gene transfer. In addition to human donor RPE cells a permanent RPE cell line (hTERT-RPE1 cells) was employed. Kationic lipids were used as transient transfection system for transfer of pCIneoIL-10 into hRPE cells. Three different lipid formulations and various ratios of transfection reagent:DNA were evaluated for highest transfection efficacy. With the optimized protocols a transfection efficacy of 23,3 ± 9,0 % (hTERT-RPE1 cells) and 10,3 ± 4,5 % (donor hRPE cells) was achieved. A negative influence on the viability of the hRPE cells after transfection was not observed. The IL-10 mRNA expression was analysed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Only in transfected hRPE cells the IL-10 mRNA-amplicon with 383 bp in size was found. Secretion of IL-10 protein in the cell culture supernatants of transfected hRPE cells was investigated using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) daily for 7 days. The IL-10 protein concentrations peaked at day 3 with 10,3 ± 0,8 ng/ml (hTERT-RPE1 cells) and 3,1 ng/ml (donor hRPE cells). The amount of secreted IL-10 positively correlated with transfection efficacy. After stimulation with the immunmodulatory cytokine interferon-gamma (IFN-g) the expression of MHC class II molecules on hRPE cells is increasing. Therefore they are able to present antigens similar to macrophages. Hence, the effects of recombinantly expressed IL-10 on the proliferation of allogeneic T lymphocytes were investigated both with and without allogeneic macrophages as professional antigen presenting cells (APC). Proliferation of T lymphocytes has been investigated colorimetrically between day 2 and day 6 (hTERT-RPE1 cells) and day 2 and day 4 (donor hRPE cells) respectively. The proliferation of allogeneic T lymphocytes with and without macrophages could be suppressed by the secreted IL-10. Signifikant reduction of proliferation was observed at day 6 in absence of professional APC (14,1 ± 1,1 % to 100% of untransfected control) and between day 5 (44,1 ± 4,9 %) and day 6 (37,4 ± 6,3%) in the presence of macrophages. It was possible to neutralize the immunosuppressive effect of IL-10 with anti-IL-10 antibodies. Proving that the suppressive effect of T lymphocyte proliferation was caused by IL-10. Thus, the specific IL-10 gene transfer into hRPE cells prior to transplantation may prevent rejection process and could prove a reliable method to help prevent loss of central vision due to AMD.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa.de:bsz:15-qucosa-37410 |
| Date | 28 November 2004 |
| Creators | Poschinger, Katharina |
| Contributors | Universität Leipzig, Veterinärmedizinische Fakultät |
| Publisher | Universitätsbibliothek Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
Page generated in 0.003 seconds