Bei der Altersabhängigen Makuladegeneration (AMD) handelt es sich um eine Erkrankung des Auges, die die Macula lutea, die Stelle des schärfsten Sehens betrifft. Sie ist verbunden mit der Degeneration von RPE-Zellen, die zur Dystrophie von Photorezeptoren und damit zum Verlust des zentralen Sehvermögens führt. Eine ähnliche Pathophysiologie ist bei der sogenannten Retinalen Pigmentepitheldystrophie (RPED) des Hundes zu beobachten. Die Transplantation von gesunden RPE-Zellen in das betroffene Gebiet stellt eine vielversprechende Therapiemöglichkeit dar. Die Transplantatabstoßung als Kom-plikation schränkt die klinische Anwendung ein. Eine beim Patienten nach Transplantation lebenslang durchgeführte systemische Immunsuppression ist mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden. Deshalb bietet die Gentherapie unter Einbezug immunsuppressiver Zytokine wie beispielsweise des Interleukin-10 (IL-10) eine Lösung. In der vorliegenden Arbeit wurde ein selbst konstruierter IL-10-Expressionsvektor (Plasmid pCIneoIL-10) mittels Gentransfer in humane RPE-Zellen in vitro eingebracht. Untersucht wurde die Wirkung des sezernierten IL-10 auf die Proliferation von allogenen T-Lymphozyten mit und ohne allogene Makrophagen als professionelle antigenpräsentierende Zellen (APC). Neben humanen Spender RPE-Zellen (Spender-hRPE-Zellen) wurde eine immortalisierte Permanent-Zelllinie (hTERT-RPE1-Zellen) eingesetzt, deren Hauptvorteil in einer gleichbleibend hohen Wachstumsrate lag. Als transientes Transfektions-system für den Transfer von IL-10-DNA in hRPE-Zellen wurden kationische Lipide gewählt. Drei verschiedene Lipidformulierungen wurden miteinander verglichen und das optimale Transfektionsreagenz:DNA-Verhältnis, mit dem die höchste Transfektionseffizienz erreicht werden konnte, evaluiert. Eine Transfektionseffizienz von 23,3 ± 9,0 % (hTERT-RPE1-Zellen) beziehungsweise 10,3 ± 4,5 % (Spender-hRPE-Zellen) konnte erreicht werden. Die Transfektion hatte weder einen negativen Einfluss auf die Vitalität der hRPE-Zellen, noch wurde der natürliche Zelltod, die Apoptose, erhöht. Die IL-10-mRNA-Expression wurde mittels RT-PCR nachgewiesen. Lediglich bei den transfizierten hRPE-Zellen konnte IL-10-mRNA gefunden werden. Mittels ELISA konnte das IL-10-Protein gemessen werden. Die Sekretion des IL-10 in den Kulturüberstand von transfizierten hRPE-Zellen wurde dafür über einen Zeitraum von 7 Tagen untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass die maximale IL-10-Proteinkonzentration bei beiden Zelllinien am Tag 3 mit Werten von 10,3 ± 0,8 ng/ml (hTERT-RPE1-Zellen) und 3,1 ng/ml (Spender-hRPE-Zellen) lag. Es bestand überdies eine positive Korrelation zwischen Transfektionseffizienz und synthetisiertem IL-10. Es wurde außerdem gezeigt, dass durch Stimulation mit dem immunmodulatorischen Zytokin Interferon-gamma (IFN-g) hRPE-Zellen MHC Klasse II-Moleküle vermehrt exprimierten. Damit sind sie ebenso wie die Makrophagen zur Antigenpräsentation fähig. Die Wirkung des von den transfizierten hRPE-Zellen sezernierten IL-10 auf die Proliferation von T-Lymphozyten wurde zwischen Tag 2 und Tag 6 (hTERT-RPE1-Zellen) beziehungsweise zwischen Tag 2 und Tag 4 (Spender-hRPE-Zellen) photometrisch untersucht. Die Proliferation allogener T-Lymphozyten mit beziehungsweise ohne Makrophagen konnte durch das sezernierte IL-10 supprimiert werden. Bei den hTERT-RPE1-Zellen lag ohne die Anwesenheit von professionellen APC am Tag 6 eine signifikante Reduktion der T-Lymphozytenproliferation vor, während bei Kokultivierung mit Makrophagen Signifikanzen am Tag 5 und Tag 6 erkennbar waren. Die immunsuppressive Wirkung von IL-10 konnte mittels Anti-IL-10-Antikörper neutralisiert werden. Damit wurde bewiesen, dass die proliferations-supprimierende Wirkung auf IL-10 zurückzuführen war. Diese Ergebnisse könnten demnach neue Möglichkeiten zur Verhinderung einer Abstoßungsreaktion nach RPE-Zelltransplantation bei Patienten mit AMD eröffnen / Age-related macular degeneration (AMD) is a disease of eyes affecting the macula lutea, the area of the retina with the highest density of retinal pigment epithelial cells (RPE cells). The disease is characterized by degeneration of RPE cells resulting in dystrophy of photoreceptors and finally loss of central vision. Transplantation of healthy RPE cells is a promising possibility for therapy but rejection of the allotransplant limits clinical application. One way to avoid this complications is a systemic immunosuppression of the recipient but this is combined with many side effects. In this thesis a self-constructed IL-10 expression vector (plasmid pCIneoIL-10) has been transferred into human RPE cells in vitro by gene transfer. In addition to human donor RPE cells a permanent RPE cell line (hTERT-RPE1 cells) was employed. Kationic lipids were used as transient transfection system for transfer of pCIneoIL-10 into hRPE cells. Three different lipid formulations and various ratios of transfection reagent:DNA were evaluated for highest transfection efficacy. With the optimized protocols a transfection efficacy of 23,3 ± 9,0 % (hTERT-RPE1 cells) and 10,3 ± 4,5 % (donor hRPE cells) was achieved. A negative influence on the viability of the hRPE cells after transfection was not observed. The IL-10 mRNA expression was analysed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Only in transfected hRPE cells the IL-10 mRNA-amplicon with 383 bp in size was found. Secretion of IL-10 protein in the cell culture supernatants of transfected hRPE cells was investigated using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) daily for 7 days. The IL-10 protein concentrations peaked at day 3 with 10,3 ± 0,8 ng/ml (hTERT-RPE1 cells) and 3,1 ng/ml (donor hRPE cells). The amount of secreted IL-10 positively correlated with transfection efficacy. After stimulation with the immunmodulatory cytokine interferon-gamma (IFN-g) the expression of MHC class II molecules on hRPE cells is increasing. Therefore they are able to present antigens similar to macrophages. Hence, the effects of recombinantly expressed IL-10 on the proliferation of allogeneic T lymphocytes were investigated both with and without allogeneic macrophages as professional antigen presenting cells (APC). Proliferation of T lymphocytes has been investigated colorimetrically between day 2 and day 6 (hTERT-RPE1 cells) and day 2 and day 4 (donor hRPE cells) respectively. The proliferation of allogeneic T lymphocytes with and without macrophages could be suppressed by the secreted IL-10. Signifikant reduction of proliferation was observed at day 6 in absence of professional APC (14,1 ± 1,1 % to 100% of untransfected control) and between day 5 (44,1 ± 4,9 %) and day 6 (37,4 ± 6,3%) in the presence of macrophages. It was possible to neutralize the immunosuppressive effect of IL-10 with anti-IL-10 antibodies. Proving that the suppressive effect of T lymphocyte proliferation was caused by IL-10. Thus, the specific IL-10 gene transfer into hRPE cells prior to transplantation may prevent rejection process and could prove a reliable method to help prevent loss of central vision due to AMD.

Retinale Hypoxie ist ein wichtiger Faktor bei der Pathogenese der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), einer Erkrankung, die mit einer chronischen Entzündungsreaktion einhergeht. Das angeborene Immunsystem besitzt eine Vielzahl von Mechanismen, um pathogene Faktoren zu erkennen und zu eliminieren. Dazu gehört u.a. das NLRP3-Inflammasom, das wahrscheinlich auch bei der AMD in der Netzhaut aktiviert ist. Die Aktivierung des Inflammasoms ist ein Zweischrittprozess: der erste Schritt, das Priming, besteht in der Transkription von NLRP3-assoziierten Genen. Im zweiten Schritt kommt es zu einer Assemblierung der Inflammasombestandteile, so dass das aktivierte Inflammasom pro-IL-1ß in das biologisch aktive IL-1ß umwandelt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es herauszufinden, ob Hypoxie in kultivierten humanen retinalen Pigmentepithelzellen (RPE)-Zellen die Transkription und Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms induziert. Es sollte auch ermittelt werden, welche Signalwege die hypoxischen Veränderungen der Genexpression von NLRP3 und des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF-A) vermitteln. Dafür wurden Untersuchungen an humanen RPE-Zellen, die in 0,2% O2 bzw. in Anwesenheit von CoCl2 kultiviert wurden, durchgeführt. Hypoxie bewirkte keine Veränderungen der Genexpression der Inflammasom-assoziierten Proteine NLRP1, NLRP6, NLRP7, NLRP12 und NLRC4, wohingegen die Expression der NLRP3- und IL-1ß-Gene sowie der NLRP3- und IL-1ß-Proteingehalt in RPE-Zellen erhöht wurden. Verschiedene Signalwege vermitteln die Hypoxie-induzierte Transkription des NLRP3-Gens. Hierzu zählen die Transkriptionsfaktoren CREB und HIF, Proteinkinase A, IP3-Rezeptoren, calcium-bindende Proteine, TRP- und SOS-Kanäle sowie autokrine/parakrine Aktivierung von EGF-, TGF-ß1-, FGF- und IL-1ß-Rezeptoren. Desweiteren wurde auch eine Beteiligung der autokrin/parakrinen Aktivierung von purinergen Rezeptoren an der hypoxischen NLRP3-Genexpression nachgewiesen. Eine Pannexin-abhängige Freisetzung von ATP trägt über eine Aktivierung von P2Y2- und Adenosin-A1-Rezeptoren zur hypoxischen Expression des NLRP3-Gens bei. Die Aktivierung der P2Y2-Rezeptoren trägt auch zur hypoxischen Expression und Sekretion von VEGF bei. Es konnte auch gezeigt werden, dass eine durch lysosomale Destabilisierung bewirkte Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms eine Verringerung der RPE-Zellviabilität unter hypoxischen Bedingungen bewirkt. Die Daten lassen vermuten, dass Hypoxie ein Faktor ist, der ein Priming und eine Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms in RPE-Zellen bewirkt. Dies könnte eine retinale Inflammation und eine Degeneration der RPE-Zellen begünstigen. Eine Aktivierung von P2Y2-Rezeptoren trägt sowohl zur Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms als auch zur Produktion des angiogenen Faktors VEGF-A in RPE-Zellen bei.:Inhaltsverzeichnis 1. Abkürzungsverzeichnis 2. Einführung 2.1. Das retinale Pigmentepithel-Aufbau und Funktionen 2.2. Die Altersbedingte Makuladegneration (AMD) 2.2.1. Epidemiologie und Ätiologie 2.2.2. Pathophysiologie und Klassifikation der AMD 2.2.2.1. Frühe AMD 2.2.2.2. GA und CNV – Spätformen der AMD 2.3. Zusammenhang zwischen AMD und Immunsystem 2.4. Das NLRP3-Inflammasom 2.4.1. Signalerkennung, Rezeptoren und Aufbau des NLRP3-Inflammasoms 2.4.2. Aktivierung des Inflammasoms 2.4.3. Wirkung von inflammatorischen Prozessen und Zytokinen auf die RPE-Zelle 2.5. Komplementsystem und AMD 2.6. Therapie der AMD 3. Aufgabenstellung 4. Materialien und Methoden 4.1. Materialien 4.1.1. Chemikalien 4.1.2. Substanzen zur Zellstimulation 4.1.3. Geräte und Sonstige Materialien 4.1.4. Primerpaare 4.1.5. Antikörper für die Western-Blot-Analyse 4.1.6. ELISA 4.2. Methoden 4.2.1. Zellkultivierung und Zellstimulation 4.2.2. Zellvitalität 4.2.3. RNA Präparation 4.2.4. cDNA Synthese 4.2.5. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) 4.2.6. Agarose – Gelelektrophorese 4.2.7. siRNA Transfektion 4.2.8. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 4.2.9. Western-Blot, Proteinbestimmung nach Bradford und SDS-PAGE 4.3. Statistische Auswertung 5. Ergebnisse 5.1. Genexpression von Inflammasom-assoziierten Proteinen 5.2. Wirkung von Hypoxie auf die Genexpression von Inflammasomproteinen 5.3. Hypoxisch induzierte Expression von NLRP3 und IL-1ß Protein 5.4. RPE Zellvitalität 5.5. Regulation der Genexpression von NLRP3 und VEGF unter hypoxischen Bedingungen 5.5.1. Transkriptionsfaktoren 5.5.2. Beteiligung intrazellulärer Signalkaskaden 5.5.2.1. NLRP3 mRNA Expression 5.5.2.2. VEGF-A mRNA-Expression 5.5.3. Beteiligung von extrazellulären Signalproteinen 5.5.3.1. NLRP3 mRNA-Expression 5.5.3.2. VEGFA-mRNA-Expression 5.5.4. Beteiligung purinerger Rezeptoren 5.5.4.1. NLRP3 mRNA Expression 5.5.4.2. VEGF-A mRNA-Expression 5.5.5. Rolle purinerger Rezeptoren bei der Hypoxie-induzierten Sekretion von VEGF 6. Diskussion 6.1. Hypoxie induziert Priming und Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms 6.2. Hypoxie-induzierte Signalwege, die die Expression von NLRP3 und VEGF-A regulieren 6.2.1. Transkriptionsfaktoren 6.2.2. Intra- und extrazelluläre Signaltransduktion 6.2.3. Rolle purinerger Rezeptoren bei der hypoxischen Expression von NLRP3 und VEGF 6.3. Chemische Hypoxie vs. Kultivierung in 0,2% O2 6.4. Einfluss der Inflammasomaktivierung auf die Expression und Sekretion von VEGF in RPE-Zellen 6.5. Mögliche klinische Bedeutung der Ergebnisse für die AMD 7. Zusammenfassung 8. Literaturverzeichnis 9. Anhang 9.1. Danksagung 9.2. Abbildungsverzeichnis 9.3. Lebenslauf 9.4. Eigenständigkeitserklärung

Die diabetische Retinopathie (DR) gilt als häufigste chronische mikrovaskuläre Komplikation bei Diabetes mellitus sowie als häufigste Erblindungsursache bei Erwachsenen im Arbeitsalter in Industrieländern. Die diabetische Stoffwechsellage führt langfristig zu Schädigungen des Gefäßendothels, was den Zusammenbruch der Blut-Retina-Schranke verursachen kann. Die Entwicklung eines diabetischen Makulaödems mit Ablagerung von harten Exsudaten steht ebenfalls in engem Zusammenhang mit Sehverlusten. Die wichtigsten Risikofaktoren der DR sind eine Hyperglykämie sowie systemische Hypertonie. Hauptursache für die diabetische Degeneration der Retina ist die Aktivierung des Polyolwegs, der bei erhöhter Glukose-Konzentration vermehrt abläuft. Im ersten Schritt entsteht durch die Aktivität der Aldosereduktase (AR) aus Glukose Sorbitol, das bei diabetischer Stoffwechsellage akkumuliert und toxisch auf die Retinazellen wirkt. Im zweiten Schritt des Polyolwegs wird durch die Sorbitoldehydrogenase Sorbitol in Fruktose umgewandelt. Durch diätetische Kochsalz (NaCl)-Aufnahme erhöht sich die extrazelluläre Osmolarität und bewirkt dadurch akute Blutdruck-Erhöhungen. Bluthochdruck führt über erhöhten Blutfluss und Endothelzellschäden zur Progression der DR. Als Therapie sind derzeit Anti-VEGF-Medikamente, Laserphotokoagulation und intravitreal applizierte Kortikosteroide bekannt. Das retinale Pigmentepithel (RPE) bildet die äußere Blut-Retina-Schranke (BRS) und hat vielfältige Funktionen für das Sehen. Es absorbiert Licht, phagozytiert Außensegmente der Fotorezeptoren, transportiert Nährstoffe und Ionen, trägt zur Ionenhomöostase und pH-Regulation bei, wandelt all-trans-Retinal für den Sehzyklus um und sezerniert verschiedene Signalmoleküle. Die Ruptur der BRS, die bei der DR beobachtet wird, kann zu erhöhter lokaler extrazellulärer Osmolarität durch Metabolit- und Ioneneinstrom und damit hyperosmolaren Stress im RPE führen. Die Plasmaosmolarität hängt vor allem vom NaCl-Spiegel im Blut ab. Reguliert wird die hohe extrazelluläre Ionenkonzentration durch organische Osmolyte, die den intrazellulären osmotischen Druck erhöhen. Dies führt zu einer Kompensation des osmotischen Gradienten über der Zellmembran und somit zu einer Stabilisierung des Zellvolumens. Unter anderem wird vermehrt Sorbitol produziert, welches in den RPE-Zellen akkumuliert. Durch Aktivierung des Polyolwegs kann es dadurch bei der DR zu Zellschädigungen kommen. Hyperosmolarer Stress verändert außerdem den transepithelialen Widerstand, das Netzhautpotenzial, die RPE-Zellzahl sowie die Proliferation und Zellzyklusphasen. Durch hohe NaCl-Spiegel werden vermehrt angiogene Wachstumsfaktoren exprimiert, die zu chorioidalen Neovaskularisationen beitragen. Schließlich kann der erhöhte osmotische Druck in der Retina zu einer exsudativen Netzhautablösung und zu retinalen Ödemen führen, wodurch das Sehen stark beeinträchtigt wird. NFAT5 ist der hauptsächliche Transkriptionsfaktor, der die Genexpression in Reaktion auf hyperosmotischen Stress reguliert. NFAT5 wird unter hypertonen Bedingungen aktiviert und führt zu einer gesteigerten AR-Expression, wodurch die Sorbitol-Produktion stimuliert wird. Es gibt Hinweise, dass eine erhöhte extrazelluläre Osmolarität über eine Aktivierung von NFAT5 die Pathogenese der DR fördert. Deshalb befasst sich diese Arbeit mit der Untersuchung der Wirkung hoher extrazellulärer NaCl-Konzentrationen auf die Gen- und Proteinexpression der Sorbitolproduzierenden und -umwandelnden Enzyme, Aldosereduktase und Sorbitol-dehydrogenase (SDH), sowie mit der Rolle des Transkriptionsfaktors NFAT5 bei kultivierten humanen RPE-Zellen. Es ergaben sich folgende Ziele: • Regulation der Expression von AR und SDH unter verschiedenen pathogenen Bedingungen wie Hyperglykämie, Hypoxie, oxidativer Stress, extrazelluläre Hyperosmolarität • Funktion intra-und extrazellulärer Signalwege und Transkriptionsfaktoren bei der AR- und SDH-Genexpression unter hyperosmolaren bzw. hypoxischen Bedingungen • Rolle der AR- und NFAT5-Aktivitäten für die Vitalität und das Proliferationsverhalten der RPE-Zellen unter hyperosmolaren und hypoxischen Bedingungen Zur Bestimmung der Genexpression der Enzyme wurden PCR-Experimente durchgeführt. Die AR-Genexpression in RPE-Zellen wurde durch hohe extrazelluläre Glukose (25 mM), CoCl2-induzierte chemische Hypoxie (150 μM), H2O2-induzierten oxidativen Stress (20 μM) und NaCl- oder Sucrose-induzierte extrazelluläre Hyperosmolarität erhöht. Durch die gleichzeitige Stimulation mit NaCl und CoCl2 wurde die AR-Genexpression additiv erhöht, was dafür spricht, dass (teilweise) verschiedene intrazelluläre Signalwege die Genexpression unter hyperosmolaren und hypoxischen Bedingungen vermitteln. Extrazelluläre Hyperosmolarität, aber nicht Hypoxie, erhöhte außerdem die AR-Proteinmenge, die mittels Western-Blot-Analyse bestimmt wurde. Um zu ermitteln, welche Signalwege und Transkriptionsfaktoren die Expressionen von AR und SDH vermitteln, wurden jeweils spezifische Inhibitoren eingesetzt. Dabei wurde festgestellt, dass unter Kontroll- und hyperosmolaren Bedingungen die JNK-Aktivität die AR-Expression erhöht, was auf eine hemmende Funktion des Signalwegs hindeutet. Die Hemmung der p38-MAPK, ERK1/2 und PI3K-Signalwege reduzierten die Expression des AR-Gens bei extrazellulärer Hyperosmolarität und Hypoxie, was nahelegt, dass diese Signalwege die AR-Genexpression verstärken. Zudem ist die JNK-Aktivität unter hypoxischen Bedingungen an der Vermittlung der NaCl-induzierten AR-Genexpression beteiligt. Es ist bekannt, dass extrazelluläre Hyperosmolarität die Sekretion von angiogenen Wachstumsfaktoren wie VEGF, bFGF und TGFβ aus RPE-Zellen induziert. Deshalb wurde untersucht, ob eine Aktivierung von Rezeptoren für diese Wachstumsfaktoren für die NaCl-induzierte AR-Genexpression in RPE-Zellen notwendig ist. Die Hemmung des VEGF-Rezeptors 2 erhöhte unter Kontrollbedingungen die AR-Genexpression. Dies deutet daraufhin, dass RPE-Zellen unter Kontrollbedingungen kontinuiertlich VEGF freisetzen. Unter hyperosmolaren Bedingungen wurde die Expression des AR-Gens durch einen Hemmer von Rezeptoren für TGFβ1 sowie einen Hemmer von MMPs vermindert. Die AR-mRNA wurde durch die Hemmung des VEGF Rezeptor-2 und der FGF-Rezeptortyrosinkinase vermehrt exprimiert. Dies deutet auf eine negative Regulation der AR-Expression unter hyperosmolaren Bedingungen durch auto- bzw. parakrine Aktivierung von VEGF- und FGF-Rezeptoren hin. Unter hypoxischen Bedingungen vermitteln die PDGF- und EGF-Rezeptortyrosinkinasen und die Kinaserezeptoren für TGFβ1 die AR-Genexpression. Für die Rolle von Transkriptionsfaktoren an der Regulation der AR wurde gezeigt, dass NFκB unter Kontrollbedingungen die AR-Expression hemmt. Unter hypoxischen Bedingungen konnte eine Rolle von HIF-1 und STAT3 bei der Erhöhung der AR-Genexpression nachgewiesen werden. Die verwendeten Transkriptionsfaktorhemmer hatten unter hyperosmolaren Bedingungen keinen Effekt auf die AR-Expression. Für die Untersuchung der NFAT5-Aktivität wurde der Transkriptionsfaktor mit Hilfe einer siRNA ausgeschaltet. Die Transfektion mit der NFAT5-siRNA reduzierte unter hyperosmolaren sowie hypoxischen Bedingungen die NFAT5-Expression in den RPE-Zellen um etwa 60 %. Diese verringerte NFAT5-Aktivität bewirkte eine Reduktion der AR-Expression unter hyperosmolaren Bedingungen, aber nicht unter Hypoxie. Die AR-Genexpression scheint spezifisch unter hyperosmolaren Bedingungen durch NFAT5 reguliert zu werden. Um zu untersuchen, wie sich die NFAT5- bzw. die AR-Aktivität auf das Überleben und die Proliferation von RPE-Zellen auswirkt, wurde NFAT5 mittels siRNA ausgeschaltet und die AR-Aktivität mit dem spezifischen Inhibitor EBPC gehemmt. Die Herunterregulation der NFAT5-Expression oder die Inhibition der AR-Aktivität verminderte die Zellvitalität unter hyperosmolaren, aber nicht unter hypoxischen Bedingungen und verstärkte die hyperosmolare Hemmung der Zellproliferation. Dies deutet darauf hin, dass eine Herunterregulation der NFAT5-Expression den Zellzyklusarrest unter hyperosmolaren Bedingungen verstärkt, während die Aktivität der AR protektiv auf die Zellen wirkt. Die SDH-Genexpression wurde durch Hypoxie und oxidativen Stress, nicht aber durch extrazelluläre Hyperosmolarität erhöht. Hyperosmolarität und Hypoxie veränderten die SDH-Proteinmenge in den Zellen nicht. Unter Kontrollbedingungen verringerte die Aktivität der JNK die SDH-Genexpression. Der PI3-Akt-Signalweg ist für die Vermittlung der Hypoxie-induzierten SDH-Genexpression von Bedeutung. Außerdem verringerte das entzündungshemmende Glukokortikoid Triamcinolon die hypoxische Expression des SDH-Gens. Weiterhin wurde eine erhöhte SDH-Genexpression durch den VEGF-Rezeptor-2-Hemmer unter Kontrollbedingungen nachgewiesen, was auf einen hemmenden Effekt der VEGF-Rezeptoraktivierung hindeutet. Die SDH-Expression wurde durch die Inhibitoren der PDGF- bzw. EGF-Rezeptortyrosinkinasen unter Hypoxie reduziert, was eine Funktion dieser Rezeptoren an der Induktion der SDH-Expression unter diesen Bedingungen nahelegt. Der Transkriptionsfaktor NFκB hemmte unter Kontrollbedingungen die SDH-Expression, während die Transkriptionsfaktoren HIF-1 und STAT3 bei der Erhöhung der SDH-Expression unter hypoxischen Bedingungen eine Rolle spielen.:Abkürzungsverzeichnis 1 EINLEITUNG 1.1 Die diabetische Retinopathie (DR) 1.1.1 Epidemiologie und Relevanz 1.1.2 Pathogenese, Klinik und Stadien 1.1.3 Systemische Risikofaktoren 1.1.3.1 Hyperglykämie 1.1.3.2 Bluthochdruck 1.1.4 Prävention 1.1.5 Therapie 1.2 Das retinale Pigmentepithel (RPE) 1.3 Epithel-Veränderungen durch hyperosmolaren Stress im Rahmen der DR 1.4 Rolle des Transkriptionsfaktors NFAT5 2 AUFGABENSTELLUNG 3 MATERIAL UND METHODEN 3.1 Materialien 3.1.1 Chemikalien 3.1.2 Geräte und sonstige Materialien 3.1.3 Kits 3.1.4 Substanzen zur Zellstimulation 3.1.5 Antikörper 3.1.6 Primer 3.2 Zellbiologische Methoden 3.2.1 Zellkultivierung 3.2.2 Vitalitätsbestimmung mittels Trypanblau-Methode 3.2.3 Bestimmung der Proliferationsraten 3.3 Molekularbiologische Methoden 3.3.1 RNA-Präparation und DNAse-Behandlung 3.3.2 RNA-Quantifizierung 3.3.3 Reverse Transkription (cDNA-Synthese) 3.3.4 Real-Time Polymerase-Chain-Reaction (RT-PCR) 3.3.5 Bestimmung der PCR-Effizienz 3.3.6 Agarose-Gelelektrophorese 3.3.7 siRNA-Transfektion 3.4 Immunologische Methoden 3.4.1 Western Blot 3.4.1.1 Proteinextraktion und quantitative Bestimmung der Proteine nach Bradford 3.4.1.2 SDS-PAGE 3.4.1.3 Western Blot 3.5 Statistische Auswertung 4 ERGEBNISSE 4.1 Regulation der Aldosereduktase (AR)- und Sorbitoldehydrogenase (SDH)-Gen- und Proteinexpression 4.1.1 AR-Genexpression unter hyperosmolaren und hypoxischen Bedingungen 4.1.1.1 Beteiligung intrazellulärer Signalwege 4.1.1.2 Beteiligung extrazellulärer Signalwege 4.1.1.3 Rolle der Transkriptionsfaktor-Aktivität 4.1.1.4 Rolle von AR- und NFAT5-Aktivität bei der Zellvitalität und -proliferation 4.1.2 SDH-Genexpression unter hypoxischen Bedingungen 4.1.2.1 Beteiligung intrazellulärer Signalwege 4.1.2.2 Beteiligung extrazellulärer Signalwege 4.1.2.3 Rolle von Transkriptionsfaktor-Aktivitäten 5 DISKUSSION 5.1 Wirkung pathologischer Bedingungen auf die Genexpression von AR und SDH 5.1.1 Aldosereduktase 5.1.2 Sorbitoldehydrogenase 5.2 Intrazelluläre Signalwege regulieren die AR-Genexpression 5.3 Extrazelluläre Signalwege regulieren die AR-Genexpression 5.4 Transkriptionsfaktoren regulieren die AR-Genexpression 5.5 Einfluss von AR- und NFAT5-Aktivität auf die Zellvitalität und -proliferation 5.6 Hypoxie-induzierte SDH-Genexpression 5.7 Diskussion der Methodik 5.8 Klinische Relevanz der gewonnenen Ergebnisse 5.9 Aktueller Forschungsstand der Therapie mit AR-Inhibitoren 5.10 Zusammenfassende Darstellung der Regulation der Polyolweg-Enzyme und Ausblick 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 LITERATURVERZEICHNIS 8 ANLAGEN 8.1 Tabellenverzeichnis 8.2 Abbildungsverzeichnis 8.3 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit / Aus den Ergebnissen kann geschlussfolgert werden, dass Sorbitol in RPE-Zellen unter hyperosmolaren Bedingungen akkumuliert, während es unter hypoxischen Bedingungen oder bei oxidativem Stress zu keiner Sorbitolakkumulation kommt. Man kann annehmen, dass die NFAT5- und AR-vermittelte Sorbitolakkumulation die RPE-Zellen unter osmotischem Stress schützt, weil es die intrazelluläre Osmolarität erhöht. Es sollten zukünftig weitere Untersuchungen zur Vitalität der Zellen bei AR-Hemmung unter verschiedenen pathogenen Bedingungen durchgeführt werden. Derzeit befinden sich eine Vielzahl vielversprechender neuer Therapiemöglichkeiten der DR in der Entwicklung, die auf biochemische Signalwege abzielen, die mikrovaskulären Schaden verursachen. Wichtig ist zudem die weitere klinische Forschung, um die Rolle dieser neuen Therapien bei der Behandlung der DR zu ermitteln.:Abkürzungsverzeichnis 1 EINLEITUNG 1.1 Die diabetische Retinopathie (DR) 1.1.1 Epidemiologie und Relevanz 1.1.2 Pathogenese, Klinik und Stadien 1.1.3 Systemische Risikofaktoren 1.1.3.1 Hyperglykämie 1.1.3.2 Bluthochdruck 1.1.4 Prävention 1.1.5 Therapie 1.2 Das retinale Pigmentepithel (RPE) 1.3 Epithel-Veränderungen durch hyperosmolaren Stress im Rahmen der DR 1.4 Rolle des Transkriptionsfaktors NFAT5 2 AUFGABENSTELLUNG 3 MATERIAL UND METHODEN 3.1 Materialien 3.1.1 Chemikalien 3.1.2 Geräte und sonstige Materialien 3.1.3 Kits 3.1.4 Substanzen zur Zellstimulation 3.1.5 Antikörper 3.1.6 Primer 3.2 Zellbiologische Methoden 3.2.1 Zellkultivierung 3.2.2 Vitalitätsbestimmung mittels Trypanblau-Methode 3.2.3 Bestimmung der Proliferationsraten 3.3 Molekularbiologische Methoden 3.3.1 RNA-Präparation und DNAse-Behandlung 3.3.2 RNA-Quantifizierung 3.3.3 Reverse Transkription (cDNA-Synthese) 3.3.4 Real-Time Polymerase-Chain-Reaction (RT-PCR) 3.3.5 Bestimmung der PCR-Effizienz 3.3.6 Agarose-Gelelektrophorese 3.3.7 siRNA-Transfektion 3.4 Immunologische Methoden 3.4.1 Western Blot 3.4.1.1 Proteinextraktion und quantitative Bestimmung der Proteine nach Bradford 3.4.1.2 SDS-PAGE 3.4.1.3 Western Blot 3.5 Statistische Auswertung 4 ERGEBNISSE 4.1 Regulation der Aldosereduktase (AR)- und Sorbitoldehydrogenase (SDH)-Gen- und Proteinexpression 4.1.1 AR-Genexpression unter hyperosmolaren und hypoxischen Bedingungen 4.1.1.1 Beteiligung intrazellulärer Signalwege 4.1.1.2 Beteiligung extrazellulärer Signalwege 4.1.1.3 Rolle der Transkriptionsfaktor-Aktivität 4.1.1.4 Rolle von AR- und NFAT5-Aktivität bei der Zellvitalität und -proliferation 4.1.2 SDH-Genexpression unter hypoxischen Bedingungen 4.1.2.1 Beteiligung intrazellulärer Signalwege 4.1.2.2 Beteiligung extrazellulärer Signalwege 4.1.2.3 Rolle von Transkriptionsfaktor-Aktivitäten 5 DISKUSSION 5.1 Wirkung pathologischer Bedingungen auf die Genexpression von AR und SDH 5.1.1 Aldosereduktase 5.1.2 Sorbitoldehydrogenase 5.2 Intrazelluläre Signalwege regulieren die AR-Genexpression 5.3 Extrazelluläre Signalwege regulieren die AR-Genexpression 5.4 Transkriptionsfaktoren regulieren die AR-Genexpression 5.5 Einfluss von AR- und NFAT5-Aktivität auf die Zellvitalität und -proliferation 5.6 Hypoxie-induzierte SDH-Genexpression 5.7 Diskussion der Methodik 5.8 Klinische Relevanz der gewonnenen Ergebnisse 5.9 Aktueller Forschungsstand der Therapie mit AR-Inhibitoren 5.10 Zusammenfassende Darstellung der Regulation der Polyolweg-Enzyme und Ausblick 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 LITERATURVERZEICHNIS 8 ANLAGEN 8.1 Tabellenverzeichnis 8.2 Abbildungsverzeichnis 8.3 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit

Bei der Altersabhängigen Makuladegeneration (AMD) handelt es sich um eine Erkrankung des Auges, die die Macula lutea, die Stelle des schärfsten Sehens betrifft. Sie ist verbunden mit der Degeneration von RPE-Zellen, die zur Dystrophie von Photorezeptoren und damit zum Verlust des zentralen Sehvermögens führt. Eine ähnliche Pathophysiologie ist bei der sogenannten Retinalen Pigmentepitheldystrophie (RPED) des Hundes zu beobachten. Die Transplantation von gesunden RPE-Zellen in das betroffene Gebiet stellt eine vielversprechende Therapiemöglichkeit dar. Die Transplantatabstoßung als Kom-plikation schränkt die klinische Anwendung ein. Eine beim Patienten nach Transplantation lebenslang durchgeführte systemische Immunsuppression ist mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden. Deshalb bietet die Gentherapie unter Einbezug immunsuppressiver Zytokine wie beispielsweise des Interleukin-10 (IL-10) eine Lösung. In der vorliegenden Arbeit wurde ein selbst konstruierter IL-10-Expressionsvektor (Plasmid pCIneoIL-10) mittels Gentransfer in humane RPE-Zellen in vitro eingebracht. Untersucht wurde die Wirkung des sezernierten IL-10 auf die Proliferation von allogenen T-Lymphozyten mit und ohne allogene Makrophagen als professionelle antigenpräsentierende Zellen (APC). Neben humanen Spender RPE-Zellen (Spender-hRPE-Zellen) wurde eine immortalisierte Permanent-Zelllinie (hTERT-RPE1-Zellen) eingesetzt, deren Hauptvorteil in einer gleichbleibend hohen Wachstumsrate lag. Als transientes Transfektions-system für den Transfer von IL-10-DNA in hRPE-Zellen wurden kationische Lipide gewählt. Drei verschiedene Lipidformulierungen wurden miteinander verglichen und das optimale Transfektionsreagenz:DNA-Verhältnis, mit dem die höchste Transfektionseffizienz erreicht werden konnte, evaluiert. Eine Transfektionseffizienz von 23,3 ± 9,0 % (hTERT-RPE1-Zellen) beziehungsweise 10,3 ± 4,5 % (Spender-hRPE-Zellen) konnte erreicht werden. Die Transfektion hatte weder einen negativen Einfluss auf die Vitalität der hRPE-Zellen, noch wurde der natürliche Zelltod, die Apoptose, erhöht. Die IL-10-mRNA-Expression wurde mittels RT-PCR nachgewiesen. Lediglich bei den transfizierten hRPE-Zellen konnte IL-10-mRNA gefunden werden. Mittels ELISA konnte das IL-10-Protein gemessen werden. Die Sekretion des IL-10 in den Kulturüberstand von transfizierten hRPE-Zellen wurde dafür über einen Zeitraum von 7 Tagen untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass die maximale IL-10-Proteinkonzentration bei beiden Zelllinien am Tag 3 mit Werten von 10,3 ± 0,8 ng/ml (hTERT-RPE1-Zellen) und 3,1 ng/ml (Spender-hRPE-Zellen) lag. Es bestand überdies eine positive Korrelation zwischen Transfektionseffizienz und synthetisiertem IL-10. Es wurde außerdem gezeigt, dass durch Stimulation mit dem immunmodulatorischen Zytokin Interferon-gamma (IFN-g) hRPE-Zellen MHC Klasse II-Moleküle vermehrt exprimierten. Damit sind sie ebenso wie die Makrophagen zur Antigenpräsentation fähig. Die Wirkung des von den transfizierten hRPE-Zellen sezernierten IL-10 auf die Proliferation von T-Lymphozyten wurde zwischen Tag 2 und Tag 6 (hTERT-RPE1-Zellen) beziehungsweise zwischen Tag 2 und Tag 4 (Spender-hRPE-Zellen) photometrisch untersucht. Die Proliferation allogener T-Lymphozyten mit beziehungsweise ohne Makrophagen konnte durch das sezernierte IL-10 supprimiert werden. Bei den hTERT-RPE1-Zellen lag ohne die Anwesenheit von professionellen APC am Tag 6 eine signifikante Reduktion der T-Lymphozytenproliferation vor, während bei Kokultivierung mit Makrophagen Signifikanzen am Tag 5 und Tag 6 erkennbar waren. Die immunsuppressive Wirkung von IL-10 konnte mittels Anti-IL-10-Antikörper neutralisiert werden. Damit wurde bewiesen, dass die proliferations-supprimierende Wirkung auf IL-10 zurückzuführen war. Diese Ergebnisse könnten demnach neue Möglichkeiten zur Verhinderung einer Abstoßungsreaktion nach RPE-Zelltransplantation bei Patienten mit AMD eröffnen / Age-related macular degeneration (AMD) is a disease of eyes affecting the macula lutea, the area of the retina with the highest density of retinal pigment epithelial cells (RPE cells). The disease is characterized by degeneration of RPE cells resulting in dystrophy of photoreceptors and finally loss of central vision. Transplantation of healthy RPE cells is a promising possibility for therapy but rejection of the allotransplant limits clinical application. One way to avoid this complications is a systemic immunosuppression of the recipient but this is combined with many side effects. In this thesis a self-constructed IL-10 expression vector (plasmid pCIneoIL-10) has been transferred into human RPE cells in vitro by gene transfer. In addition to human donor RPE cells a permanent RPE cell line (hTERT-RPE1 cells) was employed. Kationic lipids were used as transient transfection system for transfer of pCIneoIL-10 into hRPE cells. Three different lipid formulations and various ratios of transfection reagent:DNA were evaluated for highest transfection efficacy. With the optimized protocols a transfection efficacy of 23,3 ± 9,0 % (hTERT-RPE1 cells) and 10,3 ± 4,5 % (donor hRPE cells) was achieved. A negative influence on the viability of the hRPE cells after transfection was not observed. The IL-10 mRNA expression was analysed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Only in transfected hRPE cells the IL-10 mRNA-amplicon with 383 bp in size was found. Secretion of IL-10 protein in the cell culture supernatants of transfected hRPE cells was investigated using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) daily for 7 days. The IL-10 protein concentrations peaked at day 3 with 10,3 ± 0,8 ng/ml (hTERT-RPE1 cells) and 3,1 ng/ml (donor hRPE cells). The amount of secreted IL-10 positively correlated with transfection efficacy. After stimulation with the immunmodulatory cytokine interferon-gamma (IFN-g) the expression of MHC class II molecules on hRPE cells is increasing. Therefore they are able to present antigens similar to macrophages. Hence, the effects of recombinantly expressed IL-10 on the proliferation of allogeneic T lymphocytes were investigated both with and without allogeneic macrophages as professional antigen presenting cells (APC). Proliferation of T lymphocytes has been investigated colorimetrically between day 2 and day 6 (hTERT-RPE1 cells) and day 2 and day 4 (donor hRPE cells) respectively. The proliferation of allogeneic T lymphocytes with and without macrophages could be suppressed by the secreted IL-10. Signifikant reduction of proliferation was observed at day 6 in absence of professional APC (14,1 ± 1,1 % to 100% of untransfected control) and between day 5 (44,1 ± 4,9 %) and day 6 (37,4 ± 6,3%) in the presence of macrophages. It was possible to neutralize the immunosuppressive effect of IL-10 with anti-IL-10 antibodies. Proving that the suppressive effect of T lymphocyte proliferation was caused by IL-10. Thus, the specific IL-10 gene transfer into hRPE cells prior to transplantation may prevent rejection process and could prove a reliable method to help prevent loss of central vision due to AMD.