Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Marianna Gomes (mariannasouza@bce.unb.br) on 2016-12-08T16:35:33Z
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2016_AndréGustavoMachadoBertran.pdf: 53030977 bytes, checksum: 8b87d46e5db736462cd27c947d0fa8ec (MD5) / As espécies do gênero Tospovirus são importantes patógenos vegetais efontes de prejuízo à produção agrícola mundial. Os tospovírus são membros da famíliaBunyaviridae de vírus de (-)ssRNA com genoma tri-segmentado denominado L, M e S RNAs. Arelação entre o vetor e o vírus é do tipo circulativa-propagativa e sabe-se que a presença deRNAs Defectivos-Interferentes (DI-RNAs) pode interferir negativamente na habilidade de umisolado viral ser transmitido pelo inseto vetor. Nesta tese de doutorado, os capítulos 1 e 2apresentam a descoberta, a caracterização molecular e estrutural, o estudo da dinâmica deacumulação e efeitos biológicos de um novo tipo de RNA defectivo viral: RNAs Diméricos-Imperfeitos (ID-RNAs). OS ID-RNAs são moléculas de RNA viral resultantes de duplicações dosegmento S RNA apresentando deleções, ou na região 3’UTR do primeiro monômero, ou naregião 5’UTR do segundo monômero, mas nunca nas duas regiões UTR simultaneamente. OsID-RNAs foram encontrados até o momento em Polygonum ringspot virus (PolRSV) e TSWVinfectando a planta modelo Nicotiana benthamiana. O acúmulo de ID-RNAs é modificado pelatemperatura de incubação das plantas: a baixas temperaturas (18˚C) há inibição, enquanto aaltas temperaturas (30˚C) há incremento. Interessantemente, os ID-RNAs caracterizados para oisolado p105 de TSWV parecem ter influenciado negativamente o acúmulo das proteínas viraisNSm e N. O capítulo 3 apresenta o resultado de diversas estratégias para o desenvolvimento deum sistema de genética reversa para tospovírus em modelos vegetais in vivo e in vitro e modelosanimais in vitro (células de hamster e mosquito). Dentre as abordagens testadas, a expressãoheteróloga das proteínas N e L de TSWV em células de hamster foi capaz de reconhecer,replicar e transcrever em mRNA o gene-repórter mGFP4 presente em uma construção sintéticade mini-genoma tipo-DI-RNA. Curiosamente, a transfecção do mini-genoma apenas na presençada expressão heteróloga da proteína L também levou a atividade do gene-repórter. Demonstrouseainda que a adição a esse sistema de um plasmídeo dirigindo a transcrição do S RNA deTSWV foi capaz de retardar a expressão do gene-repórter. Adicionalmente, descobriu-se que atransfecção do segmento M de TSWV em orientação viral complementar foi capaz de aumentara atividade detectada para o gene-repórter hRLuc em um sistema de genética reversa paraBunyamwera virus. Foram também realizados ensaios de resgate de infecção de TSWV emcélulas de hamster e mosquito nos quais verificou-se a expressão da proteína NSs para umtratamento composto por um conjunto mínimo de plasmídeos dirigindo a transcrição dos trêssegmentos genômicos virais, sem a expressão heteróloga das proteínas N e L (hamster) e aocorrência de efeitos citopáticos caracterizados por mudanças morfológicas e formação desincícios celulares (mosquito). Os resultados qualitativos apresentados no capítulo 3 constituema primeira demonstração científica em toda a literatura científica de um sistema de genéticareversa funcional para TSWV baseado em atividade de mini-replicon. / The tospoviruses are important plant pathogens that causeconsiderable damage to many crops worldwide. The Tospovirus genus is part of the Bunyaviridaefamily of negative ssRNA viruses with tripartite genomes (L, M and S RNAs). Tospoviruses havea circulative-propagative interaction with their insect vectors. It is known that the presence ofDefective-Interfering RNAs (DI-RNAs) in an inoculum can alter the transmissibility of an isolateand interfere with symptom development attenuating it. This doctorate thesis adds to the list ofknown defective viral RNAs for tospoviruses the Imperfect-Dimer RNAs (ID-RNAs), which aredescribed in length in chapter one and chapter two regarding their molecular characterization,structural properties, the dynamics of their accumulation and their biological effects. ID-RNAs aredimer forms of the S RNA that carry in their junction sites a deletion at either the 3'UTR of the firstmonomer or the 5'UTR of the second monomer and are generated specifically in the infection ofthe plant host Nicotiana benthamiana. ID-RNAs were detected so far for Polygonum ringspotvirus (PolRSV) and TSWV. ID-RNA accumulation is modulated by temperature: low incubationtemperatures (18˚C) inhibit ID-RNA accumulation, whereas high incubation temperatures (30˚C)enhance it. The accumulation of ID-RNAs for TSWV isolate p105 had a negative effect over theprotein expression of the NSm and N viral proteins. Lastly, chapter 3 presents the results ofdiverse approaches that were tested for the development of a reverse genetics system fortospoviruses using in vivo and in vitro plant models and in vitro animal models (hamster andmosquito cell lines). In one of the approaches, the heterologous expression of the N and Lproteins of TSWV was carried out in hamster cells and was able to recognize, replicate andtranscribe the mRNA of the mGFP4 reporter-gene contained in a synthetic DI-RNA-like minigenome.Interestingly, the expression of only the L protein in association to the transfection of themini-genome also led to the reporter-gene activity. It was also shown that the transfection of aplasmid that drives the cytosolic transcription of the genomic S RNA in concert with theheterologous expression of the N and L proteins and the transfection of the reporter-carryingmini-genome had a delaying effect on the reporter-gene expression. Moreover, it is shown thatthe transfection of a plasmid driving the transcription of the M RNA from TSWV in viralcomplementary sense in the context of a Bunyamwera virus mini-replicon system promoted anenhancement of the activity of the reporter-gene hRLuc. Infectivity rescue assays were alsoperformed in both hamster and mosquito cells. Protein NSs expression was faintly detected forthe former in a treatment composed only of transcription plasmids for the L, M and S RNAs invirus complementary sense, without heterologous expression of the L and N proteins. For thelatter, cytopathological effects characterized by alteration of cell morphology and syncytiaformation were observed. Taken together, the qualitative results presented in chapter 3 constitutethe first efficient scientific demonstration of a reverse genetics system for tospovirus andrepresent an important hallmark of research for the genus Tospovirus.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/22352 |
| Date | 19 April 2016 |
| Creators | Bertran, André Gustavo Machado |
| Contributors | Nagata, Tatsuya, Turina, Massimo, Resende, Renato de Oliveira |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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