Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / La biomasa lignocelulósica es una materia prima renovable prometedora para la
producción de combustibles y productos químicos que está disponible a gran escala.
Además, la disminución de las reservas de petróleo, junto con el aumento de las
emisiones de gases de efecto invernadero, ha dado lugar a la producción y utilización
de biocombustibles. En los últimos años, diversos estudios se han centrado en la
investigación de diferentes tecnologías para la producción de bioetanol de segunda
generación y productos químicos, siendo los bioprocesos basados en hidrólisis
enzimática los que se muestran como la opción prometedora. Una etapa crítica del
proceso es la conversión de los residuos lignocelulósicos a azúcares fermentables. La
bioconversión de la celulosa es catalizada por un grupo de enzimas denominadas
celulasas. En trabajos previos se identificó y clonó el gen codificante para una
endoglucanasa desde Trametes versicolor (TvEG). El cDNA codificante para la
proteína madura fue completamente secuenciado y clonado en el vector pPIC9K, y se
expresó como una enzima extracelular activa en la levadura Pichia pastoris KM71.
En el presente estudio, como principal objetivo, se purificó y caracterizó TvEG, y se
evaluó su potencial hidrolítico en sustratos celulósicos. La cromatografía de
intercambio iónico utilizando un FPLC permitió la purificación y concentración de esta
enzima desde el sobrenadante del cultivo. Tras análisis mediante SDS-PAGE, se
encontró un tamaño molecular mayor a los 42,3 kDa esperados. La hidrólisis catalizada
por TvEG en carboximetilcelulosa (CMC) fue máxima a pH 5,6 y 55ºC. La enzima fue
estable en un rango de pH de 3 a 9, y hasta los 55ºC; temperatura sobre la cual la
estabilidad disminuyó rápidamente después de la incubación durante 15 min. TvEG
tuvo la capacidad de liberar azúcares reductores desde papel filtro, Avicel, xilano y paja
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de trigo. No obstante, las tasas de liberación en comparación a lo obtenido desde CMC
fueron bajas, a excepción de lo obtenido desde Avicel (0,0461%) considerando la alta
cristalinidad del sustrato.
En conclusión, TvEG es una endoglucanasa mesófila. Esta enzima ha demostrado una
alta capacidad para liberar azúcares reductores a partir de celulosa cristalina, por lo
que podría tener potenciales aplicaciones en la hidrólisis de biomasa lignocelulósica. / Lignocellulosic biomass is a promising renewable feedstock for production of fuels and
chemicals that is available at large scale. In addition, the declined oil reserves together
with the increased greenhouse gas emissions, has led to the production and use of
biofuels. In the last years, several studies have focused on the research of different
technologies for the production of second generation bioethanol and chemicals, being
enzymatic hydrolysis bioprocesses shown as the promising option. A critical stage in
the process is the conversion of lignocellulosic residues into fermentable sugars. The
bioconversion of cellulose is catalyzed by a group of enzymes called cellulases. At
previous works the gene coding for an endoglucanase (TvEG) from Trametes versicolor
was identified and cloned. The cDNA encoding for the mature protein was completely
sequenced and cloned into the pPIC9K vector, and expressed as an active extracellular
enzyme in the yeast Pichia pastoris KM71 (Salinas et al, 2011).
In the present study, as main objective, TvEG was purified and characterized, and its
hydrolytic potential in cellulosic substrates was evaluated. Ion exchange
chromatography using FPLC allowed the enzyme purification and concentration from
the culture supernatant. After SDS-PAGE analysis, a molecular size higher than the
42,3 kDa expected was found. The hydrolysis catalyzed by TvEG in carboxymethyl
cellulose (CMC) was maximal at pH 5,6 and 55°C. The enzyme was stable in a pH
range of 3 to 9, and up to 55ºC; above which stability decreased rapidly after incubation
for 15 minutes. TvEG had the ability to release reducing sugars from filter paper, Avicel
and wheat straw. However, the release rates compared to that obtained from CMC
were lower, except for Avicel (0,0461%) considering the substrate high crystallinity.
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In conclusion, TvEG is a mesophilic endoglucanase. This enzyme had been shown a
high capacity to release reducing sugars from crystalline cellulose, so could have
potential applications in the hydrolysis of lignocellulosic biomass
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/146617 |
| Date | 08 1900 |
| Creators | Cordero Carrasco, Engel Soledad |
| Contributors | Cifuentes Guzmán, Víctor, Salazar Aguirre, María Oriana |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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