Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Le ribozyme "hammerhead" ou "en tête de marteau" appartient à une classe d'ARN catalytiques qui fut découverte pour la première fois chez certains viroïdes de plantes. Le ribozyme hammerhead peut spécifiquement reconnaître et cliver des ARN cibles par simple appariement des paires de bases entre le substrat et le ribozyme. Cela le rend un candidat attirant pour inactiver l'expression de gènes spécifiques in vivo. Cependant, dans le but d'utiliser ce ribozyme comme un agent antiviral et anticancer, il est important d'augmenter l'efficacité et la reproductibilité de son activité in vivo.
Dans ce projet, nous utilisons Escherichia coli comme système modèle pour étudier l'effet de facteurs cellulaires sur l'activité du ribozyme in vivo. Il a été proposé que le couplage des processus de transcription et de traduction chez les bactéries pouvait limiter l'accès du ribozyme à sa séquence cible. Nous avons évalué l'inhibition du gène de la chloramphénicol acétyle transférase (CAT), codé sur un plasmide, par le ribozyme hammerhead chez E. coli dans des conditions où la transcription et la traduction ont été découplées soit par une augmentation de la vitesse de transcription, soit par une réduction de la vitesse de traduction. Dans une souche mutante de E. coli où la vitesse de traduction est réduite à 5.6 a.a./sec (la vitesse normale est de 15 a.a./sec), nous avons trouvé que l'activité de la CAT et le niveau d'ARNm de la CAT étaient réduits de près de 60%, alors que la présence d'un ribozyme n'avait aucun effet sur l'activité de la CAT dans une souche sauvage de E. coli. L'addition de streptomycine dans le milieu de culture, qui augmente la vitesse de traduction dans la souche mutante, rétablit la pleine activité de la CAT.
Pour pousser plus loin l'idée que la souche à ribosomes lents facilite l'activité du ribozyme, nous avons incorporé le gène de la CAT dans le génome des souches sauvage et mutante. Dans ce cas, l'activité du ribozyme était détectable dans la souche sauvage et elle était grandement augmentée dans la souche à ribosomes lents. D'autre part, l'expression du gène de la CAT avec un promoteur de l'ARN polymérase T7, ce qui augmente la vitesse de transcription de ce gène, n'est pas affectée par le ribozyme hammerhead. Puisque la rapidité de l'ARN polymérase T7 devrait dissocier la transcription de la traduction, la dissociation de ces processus n'est donc pas une condition suffisante pour augmenter l'activité du ribozyme in vivo.
Pour tester l'hypothèse que la vitesse de traduction pourrait affecter l'activité du ribozyme, nous avons testé trois ribozymes dirigés contre différentes régions de l'ARNm de la CAT. Nous avons trouvé que les trois possèdent des activités similaires. Il semble donc que l'accessibilité des régions 5' et 3' de l'ARNm de la CAT soit équivalente pour les ribozymes. Nous avons aussi utilisé d'autres stratégies pour ralentir la vitesse de traduction, soit l'insertion de codons à faible usage dans le gène de la CAT et la mutation de la séquence Shine-Dalgarno du gène de la CAT. Cependant, aucune de ces stratégies n'augmente l'activité du ribozyme. Ainsi, une vitesse inférieure de traduction ne peut expliquer l'amélioration de l'activité du ribozyme dans la souche à ribosomes lents.
Nos résultats suggèrent qu'un facteur cellulaire inconnu affecte l'activité du ribozyme in vivo. À savoir si l'allèle mutant dans la souche à ribosomes lents, le gène S12, et son activité de chaperonne pourrait être impliqué est maintenant sujet de plus amples travaux. Ce système bactérien offre une fenêtre unique pour l'étude des facteurs cellulaires pouvant affecter l'activité des ribozymes in vivo.
Nous avons aussi été impliqués dans l'étude d'ARN catalytiques dans la levure (Saccharomyces cerevisiae) dans l'espoir de comprendre comment l'environnement cellulaire de la levure affecte la fonction d'un ARN catalytique. Il a été démontré au Chapitre IV que l'activité de clivage d'un ribozyme peut être détectée par une nouvelle technique, le PCR dépendant de la ligation d'un ARN, quand le gène cible ADE1 est exprimé en cis du ribozyme, mais aucune activité en trans n'a pu être détectée dans ce même système. Ceci peut suggérer que l'association du ribozyme avec sa cible ainsi que l'activité catalytique du ribozyme sont plus lentes que le métabolisme des ARN dans la levure. Au Chapitre V, ceci a été démontré par l'arrêt du cycle cellulaire de la levure par trois différents traitements permettant une pause des cellules en phase G1, ce qui ralentit le métabolisme des ARNm. Dans ce cas, l'activité du ribozyme hammerhead dans la levure est détectée par l'évaluation directe de la concentration de l'ARNm de ADE1. Ces résultats indiquent que l'activité du ribozyme est influencée par l'environnement cellulaire.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/33609 |
| Date | 02 1900 |
| Creators | Chen, Hui |
| Contributors | Cedergren, Robert J. |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | thesis, thèse |
| Format | application/pdf |
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