Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2005. / Titre de l'écran-titre (visionné le 28 novembre 2005). Bibliogr.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Le ribozyme "hammerhead" ou "en tête de marteau" appartient à une classe d'ARN catalytiques qui fut découverte pour la première fois chez certains viroïdes de plantes. Le ribozyme hammerhead peut spécifiquement reconnaître et cliver des ARN cibles par simple appariement des paires de bases entre le substrat et le ribozyme. Cela le rend un candidat attirant pour inactiver l'expression de gènes spécifiques in vivo. Cependant, dans le but d'utiliser ce ribozyme comme un agent antiviral et anticancer, il est important d'augmenter l'efficacité et la reproductibilité de son activité in vivo. Dans ce projet, nous utilisons Escherichia coli comme système modèle pour étudier l'effet de facteurs cellulaires sur l'activité du ribozyme in vivo. Il a été proposé que le couplage des processus de transcription et de traduction chez les bactéries pouvait limiter l'accès du ribozyme à sa séquence cible. Nous avons évalué l'inhibition du gène de la chloramphénicol acétyle transférase (CAT), codé sur un plasmide, par le ribozyme hammerhead chez E. coli dans des conditions où la transcription et la traduction ont été découplées soit par une augmentation de la vitesse de transcription, soit par une réduction de la vitesse de traduction. Dans une souche mutante de E. coli où la vitesse de traduction est réduite à 5.6 a.a./sec (la vitesse normale est de 15 a.a./sec), nous avons trouvé que l'activité de la CAT et le niveau d'ARNm de la CAT étaient réduits de près de 60%, alors que la présence d'un ribozyme n'avait aucun effet sur l'activité de la CAT dans une souche sauvage de E. coli. L'addition de streptomycine dans le milieu de culture, qui augmente la vitesse de traduction dans la souche mutante, rétablit la pleine activité de la CAT. Pour pousser plus loin l'idée que la souche à ribosomes lents facilite l'activité du ribozyme, nous avons incorporé le gène de la CAT dans le génome des souches sauvage et mutante. Dans ce cas, l'activité du ribozyme était détectable dans la souche sauvage et elle était grandement augmentée dans la souche à ribosomes lents. D'autre part, l'expression du gène de la CAT avec un promoteur de l'ARN polymérase T7, ce qui augmente la vitesse de transcription de ce gène, n'est pas affectée par le ribozyme hammerhead. Puisque la rapidité de l'ARN polymérase T7 devrait dissocier la transcription de la traduction, la dissociation de ces processus n'est donc pas une condition suffisante pour augmenter l'activité du ribozyme in vivo. Pour tester l'hypothèse que la vitesse de traduction pourrait affecter l'activité du ribozyme, nous avons testé trois ribozymes dirigés contre différentes régions de l'ARNm de la CAT. Nous avons trouvé que les trois possèdent des activités similaires. Il semble donc que l'accessibilité des régions 5' et 3' de l'ARNm de la CAT soit équivalente pour les ribozymes. Nous avons aussi utilisé d'autres stratégies pour ralentir la vitesse de traduction, soit l'insertion de codons à faible usage dans le gène de la CAT et la mutation de la séquence Shine-Dalgarno du gène de la CAT. Cependant, aucune de ces stratégies n'augmente l'activité du ribozyme. Ainsi, une vitesse inférieure de traduction ne peut expliquer l'amélioration de l'activité du ribozyme dans la souche à ribosomes lents. Nos résultats suggèrent qu'un facteur cellulaire inconnu affecte l'activité du ribozyme in vivo. À savoir si l'allèle mutant dans la souche à ribosomes lents, le gène S12, et son activité de chaperonne pourrait être impliqué est maintenant sujet de plus amples travaux. Ce système bactérien offre une fenêtre unique pour l'étude des facteurs cellulaires pouvant affecter l'activité des ribozymes in vivo. Nous avons aussi été impliqués dans l'étude d'ARN catalytiques dans la levure (Saccharomyces cerevisiae) dans l'espoir de comprendre comment l'environnement cellulaire de la levure affecte la fonction d'un ARN catalytique. Il a été démontré au Chapitre IV que l'activité de clivage d'un ribozyme peut être détectée par une nouvelle technique, le PCR dépendant de la ligation d'un ARN, quand le gène cible ADE1 est exprimé en cis du ribozyme, mais aucune activité en trans n'a pu être détectée dans ce même système. Ceci peut suggérer que l'association du ribozyme avec sa cible ainsi que l'activité catalytique du ribozyme sont plus lentes que le métabolisme des ARN dans la levure. Au Chapitre V, ceci a été démontré par l'arrêt du cycle cellulaire de la levure par trois différents traitements permettant une pause des cellules en phase G1, ce qui ralentit le métabolisme des ARNm. Dans ce cas, l'activité du ribozyme hammerhead dans la levure est détectée par l'évaluation directe de la concentration de l'ARNm de ADE1. Ces résultats indiquent que l'activité du ribozyme est influencée par l'environnement cellulaire.

Malgré les améliorations significatives apportées par la thérapie antirétrovirale à la durée et à la qualité de vie des personnes vivant avec le VIH, elle ne permet pas de complètement éliminer le virus de l’organisme. La persistance du virus est due à l’existence de réservoirs viraux, des cellules infectées de manière latente par le VIH. Ces réservoirs nécessitent un traitement antirétroviral à vie, car le virus réapparait en cas d’interruption du traitement, signifiant que l’immunité des cellules T spécifiques du VIH n’est pas restaurée. Bien que cela soit théoriquement possible, seule une fraction de personne vivant avec le VIH, appelée Contrôleurs Élites, parvient à contrôler le virus en absence de traitement. Pour la majorité des individus, l’infection par le VIH entraîne une évasion virologique ainsi qu’un épuisement et une altération des réponses cellulaires spécifiques au VIH. À ce jour, les stratégies thérapeutiques visant à éliminer les réservoirs viraux ont échoué, en partie en raison de la présence de provirus principalement défectifs dans ces réservoirs. Dans cette thèse, nous avons identifié et caractérisé les provirus défectifs latents du VIH pouvant être transcrits et/ou traduits, ainsi que la relation entre ces réservoirs et les réponses immunitaires spécifique du virus. Dans un premier temps, nous avons montré que bien que défectifs et potentiellement incapable de donner lieu à la réplication virale, ces provirus peuvent être transcrits et traduits soit par réactivation à l’aide d’agents de réversion de la latence, soit de manière spontanée. Ces réservoirs donnent lieu à plusieurs populations de réservoirs, en fonction de la présence ou de l’absence certains gènes viraux. Nous avons déterminé que ces différentes populations sont régies par le profil génomique des cellules infectées. Les provirus identifiés étaient très rarement intacts, mais l’intégrité du génome était associée à la processivité de la transcription et de la traduction. Dans un second objectif, nous avons caractérisé les réponses T CD4+ et CD8+ spécifiques du VIH avant et après le début du traitement antirétroviral. Nous avons observé que les réponses T CD4+ spécifiques étaient comparables pendant l’infection chronique et après le traitement. En revanche, les réponses T CD8+ diminuaient considérablement après l’initiation de la thérapie antirétrovirale. Nous avons également constaté que la taille du réservoir traductionnellement actif pendant le traitement antirétroviral était négativement associée aux réponses T CD8+ spécifiques avant le début de la thérapie, tandis que le réservoir incapable de traduire les protéines du VIH subsistait. Ces observations mettent en évidence le rôle des cellules T CD8+ dans le contrôle de l’infection par le VIH, comme nous l’avons observé chez les Contrôleurs Élites. Nos travaux contribuent à une meilleure compréhension des réservoirs viraux du VIH, qui pourraient potentiellement être impliqués dans l’inflammation chronique et la dysfonction immunitaire associé à la pathogénèse du VIH. / Despite the significant improvement brought by antiretroviral therapy in the duration and quality of life for people living with HIV, it does not completely eliminate the virus from the body. The persistence of the virus is due to the existence of viral reservoirs, which are cells latently infected with HIV. These reservoirs require lifelong antiretroviral treatment because of the viral rebound reoccurring in case of treatment interruption. This suggests that HIV-specific T cell immunity is not restored. Although theoretically possible, only a fraction of people living with HIV, known as Elite Controllers, are able to control the virus in the absence of treatment. For the majority of individuals, HIV infection leads to virologic escape, as well as exhaustion and altered cellular responses to HIV. To date, therapeutic strategies aimed at eliminating viral reservoirs have failed, partly due to the presence of predominantly defective proviruses in these reservoirs. In this thesis, we have identified and characterized latent defective proviruses of HIV that can be transcribed and/or translated. We also have characterized the relationship between these reservoirs and the specific immune responses to the virus. Firstly, we have shown that although defective and potentially replication-incompetent, these proviruses can be transcribed and translated either through reactivation using latency reversal agents or spontaneously. These reservoirs give rise to several populations of reservoirs, depending on the presence or absence of certain viral genes. We have determined that these different populations are governed by the genomic profile of infected cells. The identified proviruses were rarely intact, and genome integrity was associated with the processivity of transcription and translation. Then, we characterized the specific CD4+ and CD8+ T cell responses to HIV before and after the initiation of antiretroviral treatment. We observed that specific CD4+ T cell responses were comparable during chronic infection and after treatment. However, CD8+ T cell responses decreased significantly after the initiation of antiretroviral therapy. We also found that the size of the translationally active reservoir during antiretroviral treatment was negatively associated with the specific CD8+ T cell responses prior to treatment initiation, while the translation-incompetent cells persisted. These observations highlight the role of CD8+ T cells in the control of HIV infection, as observed in Elite Controllers. Our work contributes to a better understanding of HIV viral reservoirs, which could potentially be involved in chronic inflammation and immune dysfunction associated with HIV pathogenesis.