Glioblastoma (GB) é o tumor cerebral humano mais frequente e maligno. O prognóstico dos pacientes com GB permanece alarmante, principalmente devido à baixa eficácia das estratégias terapêuticas atuais além da natureza invasiva desse tipo de câncer. Uma característica de tumores sólidos é apresentar áreas hipóxicas. Microambientes hipóxicos contribuem para a progressão do câncer, resistência ao tratamento e ao prognóstico ruim da doença. Dessa forma, neste trabalho, desenvolvemos um modelo in vitro que se aproxima ao microambiente hipóxico tumoral in vivo. Nossos resultados sugerem que a privação de oxigênio (PO) em combinação com ausência de soro forneceu um ambiente favorável à desdiferenciação das células C6 em células tronco tumorais (CTT). A doxazosina (DOX), um antihipertensivo utilizado na clínica, apresenta efeitos antitumorais em diversos tipos de câncer. Assim, avaliamos o efeito antitumoral da doxazosina em linhagens de glioma de rato (C6) e humano (U138-MG) e a toxicidade do fármaco em culturas primárias de astrócitos e culturas organotípicas de hipocampo. A doxazosina induziu morte celular nas linhagens de glioma e apresentou baixa neurotoxicidade. Além disso, o fármaco inibiu a via da PI3K/Akt e ativou GSK-3β e p53, resultando em indução de apoptose e parada no ciclo celular na fase G0/G1. Considerando a importância da mitocôndria na plasticidade de células tumorais e a resistência ao tratamento apresentada pelos GB, nós analisamos os efeitos da DOX nas interações entre núcleo e mitocôndrias. A DOX induziu biogênese mitocondrial e apoptose nas células C6 e diminuiu secreção de TNF-α. Ao analisar a estrutura química da DOX, encontramos diversas características que indicam que ela possui autofluorescência. Dessa forma, caracterizamos a autofluorescência da DOX em diversos meios. Observamos que há um padrão de distribuição do fármaco nas células C6: ele se encontra ao redor do núcleo e parece estar vesiculado. A superexpressão do receptor do fator de crescimento epidermal (EGFR) está relacionada às formas mais malignas e resistentes de GBs. Portanto, analisamos se a ação antiglioma da DOX está envolvida com EGFR. O tratamento com DOX foi capaz de diminuir os níveis de p-EGFR. O co-tratamento de DOX e AG1478 (inibidor de receptores de tirosina cinase) diminuiu a fosforilação de EGFR e causou necrose. Em vista disso, nossos resultados sugerem que o mecanismo de ação da DOX envolve sinalização de EGFR. Por fim, nós avaliamos os efeitos da DOX livre e nanoencapsulada (DOX-NC) em modelos in vitro e in vivo de glioma. Demonstramos que a DOX-NC induziu morte celular em linhagem de glioma em concentrações 100 vezes menores do que as que utilizamos para a DOX na sua forma livre. Além disso, analisamos o efeito da DOX-NC em culturas organotípicas de hipocampo e, da mesma maneira que o observado com a DOX, a DOX-NC demonstrou baixa toxicidade e diminuiu a área tumoral in vivo, sendo seletiva para células cancerosas. Nesta tese, alteramos o microambiente in vitro de células de glioma, avaliamos os efeitos antitumorais da doxazosina em sua forma livre e nanoencapsulada. Além disso, utilizamos modelos de glioma in vitro e in vivo e em diversos parâmetros celulares, descrevemos a autofluorescência do fármaco e também utilizamos essa característica para avaliar a captação e a distribuição da doxazosina em células de glioma. Nossos resultados contribuíram para aproximar os modelos de estudo com o que ocorre em gliomas in vivo e para evidenciar o potencial terapêutico da doxazosina como um agente antiglioma com baixa toxicidade neural e sistêmica. / Glioblastoma (GB) is the most frequent and malignant human brain tumor. The prognosis of patients with GB remains dismal, mainly due to the low effectiveness of current therapeutic strategies and the invasive nature of this type of cancer. A characteristic of solid tumors is the presence of hypoxic areas. Hypoxic microenvironments contribute to cancer progression, resistance to treatment, and poor prognosis of the disease. Thus, we developed an in vitro model that approximates the hypoxic tumor microenvironment found in vivo. Our results suggest that OD in combination with absence of serum provided an environment favorable to the dedifferentiation of C6 cells in cancer stem cells. Doxazosin (DOX), an antihypertensive used in the clinic, has antitumor effects in several types of cancer. Thus, we evaluated the antitumor effect of DOX on rat (C6) and human (U138-MG) glioma cell lines and drug toxicity in primary astrocyte cultures and organotypic hippocampal cultures. DOX induced cell death in glioma lines and showed low neurotoxicity. In addition, the drug inhibited the PI3K/Akt pathway and activated GSK-3β and p53, resulting in induction of apoptosis and cell cycle arrest in the G0/G1 phase. Considering the importance of mitochondria in the plasticity of tumor cells and the resistance to treatment presented by glioblastomas, we analyzed the effects of DOX the interactions between nucleus and mitochondria. DOX induced mitochondrial biogenesis and apoptosis in C6 cells, and decreased TNF-α secretion. When analyzing the chemical structure doxazosin, we find several characteristics that indicate that it has autofluorescence. Thus, we characterized the autofluorescence of DOX in several media. We observed that there is a pattern of distribution of the drug in the cell: it is around the nucleus and appears to be vesiculated. Overexpression of the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) is related to the more malignant and resistant forms of GBs. Therefore, we analyzed whether the antiglioma action of DOX is involved with EGFR. DOX treatment was able to decrease p-EGFR levels. Co-treatment of DOX and AG1478 (a receptor tyrosine kinase inhibitor) decreased EGFR phosphorylation and caused necrosis. Thus, our results suggest that the mechanism of action of doxazosin involves EGFR signaling. We evaluated the effects of free and nanoencapsulated doxazosin (DOX-NC) in in vitro and in vivo models of glioma. We demonstrated that nanoencapsulated doxazosin (DOX-NC) induced cell death in a glioma line at concentrations 100 times lower than those used for doxazosin in its free form. In addition, we analyzed the effect of DOX-NC on organotypic hippocampal cultures and, in the same way as observed with DOX, DOX-NC demonstrated low toxicity and decreased tumor area in vivo, being selective for cancer cells. In this dissertation, we altered the in vitro microenvironment of glioma cells, we evaluated the antitumor effects of doxazosin in its free and nanoencapsulated form. In addition, we used glioma models in vitro and in vivo and analyzed several cellular parameters, we described the autofluorescence of the drug and also used this characteristic to evaluate the uptake and distribution of doxazosin in glioma cells. Our results have contributed to approximate the study models with what occurs in gliomas in vivo and to evidence the therapeutic potential of doxazosin as an antiglioma agent with low neural and systemic toxicity.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:lume.ufrgs.br:10183/163744 |
| Date | January 2017 |
| Creators | Gaelzer, Mariana Maier |
| Contributors | Salbego, Christianne Gazzana |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS, instname:Universidade Federal do Rio Grande do Sul, instacron:UFRGS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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