Poteínas recombinantes simples, como a insulina e o hormônio de crescimento humano, podem ser produzidas em microorganismos como bactérias Entretanto, para a produção de proteínas que precisam de modificações pós-traducionais, que não se consegue em microorganismos, torna-se importante o uso de biorreatores com culturas de células eucarióticas. Este sistema de produção é caro e a quantidade de proteína produzida é pequena. Como alternativa surgiu o uso de animais transgênicos para reduzir os custos de produção. A Eritropoietina humana é uma proteina glicosilada e representa um dos maiores gastos para tratamento de doenças humanas. Já foi produzida em camundongos, coelhos e suínos transgênicos, com problemas na glicosilação ou alteração da higidez do animal pela falha da região promotora do vetor de transgene em limitar a expressão para a glâmdula mamária. Este estudo teve como objetivo a produção de (rhEPO) no leite de camundongas transgênicas sob ação de dois diferentes vetores, nunca utilizados na sua produção. Os vetores com os promotores da alfa-lactalbumina e beta-lactoglobulina bovinos tiveram o gene da eritropoietina humana inserido entre as regiões promotora e codificadora do leite, num processo trabalhoso e pouco eficiente. Não foi possível inserir os vetores serão nas células tronco-embrionárias (CTE) de camundongos (USP-1) por eleroporação, mas as condições (390V por 80µs) foram testadas com vetor de fluorescência. Futuramente as CTE transgênicas serão agregadas aos embriões colhidos de camundongas superovuladas e após 24 horas de cultivo in vitro serão transferidos para camundongas pseudo-gestantes. Os animais nascidos (quimeras) serão acasalados e seus descendentes terão o DNA analisado para verificar a presença do gene da eritropoietina humana. Os animais positivos (fundadores) serão acasalados e as fêmeas positivas nascidas serão acompanhadas quanto à produção da eritropoietina humana no leite. Será purificada do leite, quantificada e avaliada quanto a glicosilação por Western Blottin. / Recombinant proteins such as insulin and human growth hormone can be produced by microorganisms. Although, to produce proteins that need pos-traductional modifications that can not be done by microorganisms, and a eucariotic cell bioreactor is needed. This production system is expensive and the amount of protein produced is low. As an alternative, the transgenic animal technology came up to reduce production fees. The human eritropoetin is a glicosilated protein and it is one of the most expensive to human treatment. It was already produced in transgenic mice, rabbit and swine but with glicosilation problems or health alterations by transgene vectors promoter region failure that limits the expression on mammary gland. This study aimed to produce recombinant human erythropoetin (rhEPO) in transgenic mice milk by two different vectors, never had been used to produce it before. Vectors with bovine alpha-lactalbumin and beta-lactoglobulin promoters had the human erythropoetin gene inserted between promoter and milk coding regions by a hard working and low efficiency technique. It was not possible to insert our vectors on mice embryonic stem cells (ESC) (USP-1) by electroporation but its conditions (390V, 80µs) were tested with fluorescent vector. In the future, transgenic ESC will be aggregated into mice embryos and after 24 hours of in vitro culture will be transferred to pseudo-pregnant mices. The new borns (chimera) will be mated and its offspring will have their DNA evaluated to verify the human eritropoetin gene occurrence. The founder animals will be also mated and the positive female borned will be evaluated for human erythrpoetin production on milk. It will be purified, quantified and evaluated for glicosilation by western blottin techinique.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-29052009-134917 |
| Date | 27 February 2009 |
| Creators | Mendes, Camilla Mota |
| Contributors | Visintin, José Antônio |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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