Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-10-16T17:26:26Z
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Previous issue date: 2007 / O transplante de ilhotas pode ser uma opção para o tratamento do Diabetes do
tipo I em função do aumento do controle metabólico e da qualidade de vida do
paciente transplantado. As maiores limitações para a aplicação dessa técnica em larga
escala são o alto número de ilhotas necessárias para a obtenção de um bom
funcionamento do transplante e a deteriorização de ilhotas, causados por dano
isquêmico por preservação a frio. Aqui propomos o uso de nova tecnologia
denominada TAT- PTD como transportador de moléculas terapêuticas para o interior
de ilhotas e pâncreas com a intenção de prevenir morte de ilhotas, aumentando, assim,
o número e a qualidade das ilhotas para transplante de pacientes diabéticos.
Resultados da Parte I:
Construímos uma proteína de fusão composta por Heme oxigenase -1 (HO1) e o
domínio de transdução protéica TAT- PTD (TAT) um peptídeo viral com 11
aminoácidos provenientes do vírus da imunodeficiência humana (HIV) e com
capacidade de penetrar em membrana plasmática. A transdução de TAT-PTD-HO1
em células produtoras de insulina protege contra a ação citotóxica de TNF-α. A
transdução de TAT-HO1 para o interior de células produtoras de insulina não danifica
a fisiologia de ilhotas como foi mostrado quando estas são transplantadas em
camundongos imunodeficientes e com Diabetes quimicamente induzida. Finalmente,
mostramos que transdução de ilhotas com a proteína de fusão melhora a viabilidade
de ilhotas em cultura. Essa abordagem pode ter um impacto positivo no aumento da
disponibilidade de ilhotas para transplante.
Resultados da Parte II:
A produção de proteínas de fusão ligadas a TAT-PTD pode ser obtida em larga escala
e eficientemente com a expressão protéica em E. coli. No entanto, a contaminação
com endotoxina representa um problema para a aplicação dessas proteínas in vitro e in
vivo. Desenvolvemos várias proteínas de fusão ligadas a TAT que têm aplicação
terapêuticas em ilhotas. Apresentamos aqui um novo método para a eficiente remoção
de endotoxina de soluções protéicas usando tubos de polipropileno em combinação
com tratamento em pH ácido, mantendo a atividade biológica da proteína com bom
rendimento protéico.
Resultados da Parte III:
Para poder detectar possíveis moléculas que possam ser citoprotetoras e que possam
ser associadas à tecnologia de TAT-PTD, estabelecemos um modelo de isquemia a
frio em pâncreas de ratos. Isso nos permitiu estudar a modulação de vias ativadas por
sinal de stress que levam ao impedimento da recuperação da qualidade e função de
ilhotas. Observamos que JNK e p38 são proteínas kinase ativadas por stress (SAPK)
que estão presentes por causa de dano causado por isquemia pancreática e isolamento
de ilhotas. Um experimento preliminar usando TAT-D-JNKi, inibidor de JNK, tentou
prevenir dano causado pela ativação de JNK. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Islet transplantation can become a therapeutic option for the treatment of Type
I Diabetes due to increased metabolic control and quality of life for transplanted
patients. The major limitations for widespread application of this technique are, high
number of islets needed to attain good function after transplantation and islet
deterioration caused by pancreatic injury through cold ischemia storage. We here
propose the use of a new technology using TAT-PTD as a transporter of therapeutic
molecules into islets/pancreas with the attempt to prevent islet cell death and increase
islet number/quality for transplantation of diabetic patients.
Results from Part I:
We have generated a fusion protein composed of HO-1 and TAT protein transduction
domain (TAT/PTD), an 11-aa cell penetrating peptide from the human
immunodeficiency virus TAT protein. Transduction of TAT/PTD–HO-1 to insulin
producing cells protects against TNF-a-mediated cytotoxicity. TAT/PTD–HO-1
transduction to islets does not impair islet physiology, as assessed by reversion of
chemically induced diabetes in immunodeficient mice. Finally, we report that
transduction of HO- 1 fusion protein into islets improves islet viability in culture. This
approach might have a positive impact on the availability of islets for transplantation.
Results from Part II: While production of TAT-PTD-bound protein can be
efficiently attained by E. coli protein replication, contamination with endotoxin
represents a major hindrance for application of these proteins in the context of in vitro
and in vivo testing. We have developed several TAT-attached proteins that have
therapeutic cytoprotection applications on islet. Here we present a novel method for
efficient removal of endotoxin from proteins in polypropylene tubes in combination
with acidic pH treatment that does not interfere with biological activity of the protein
and has good protein recovery.
Results from part III: In order to identify possible molecular targets for islet
cell cytoprotection by TAT-PTD technology, we have established a rat pancreas cold
ischemia model and readout systems allowing for the study of the modulation of
stress-activated cellular pathways leading to impairment of islet cell recovery and
quality. We have observed that JNK and p38 stress activated protein kinases
(SAPKs) are activated as a result of pancreas ischemia and islet isolation. A
preliminary experiment was done using TAT-D-JNK inhibitor to try to prevent or
reduce islet damage caused by activation of this SAPK pathway using this stringent
model system.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/5771 |
| Date | January 2007 |
| Creators | Ribeiro, Melina Magalhães |
| Contributors | Felipe, Maria Sueli Soares, Pastori, Ricardo L. |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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