Einleitung
Der intensive Einsatz von Pflanzenschutzmitteln in der konventionellen Landwirtschaft kann zum Eintrag von Rückständen in die Nahrungskette führen. Milchliefernde Rinder nehmen Pflanzenschutzmittelrückstände mit dem Futter auf, die durch aktive Sekretion in die Milch eine Gefährdung für sensible Bevölkerungsgruppen, wie Kinder, verursachen könnten. Die in nationalen Rückstandskontrollen untersuchten Milchproben unterschreiten zwar in der Regel die gesetzlich festgelegten Höchstgrenzen (Maximum Residue Level, MRL), jedoch kann eine andauernde Belastung mit Pflanzenschutzmitteln die Entstehung chronischer Erkrankungen, wie Morbus Parkinson und Kinderleukämie, fördern.
Im Rindereuter stellt der ATP-binding cassette Transporter der Subfamilie G2 (ABCG2) den wichtigsten Transportweg für Fremdstoffe in die Milch dar. Mit seinem breiten Substratspektrum ist der bovine ABCG2-Transporter (bABCG2) in der Lage, unterschiedliche Substrate in die Kuhmilch zu transportieren. Jedoch ist bislang unklar, ob auch Pflanzenschutzmittel bABCG2-vermittelt in die Milch sezerniert werden können und ob die gleichzeitige Aufnahme mehrerer Rückstände die bABCG2-Effluxaktivität beeinflusst.
Ziele der Untersuchungen
Ziel dieser Arbeit war die Identifikation von Pflanzenschutzmitteln als mögliche Substrate des bovinen Effluxtransporters. Weiterhin wurde untersucht, ob zwischen zwei Wirkstoffen synergistische oder antagonistische Effekte am bABCG2-Transporter auftreten.
Material und Methoden
Es wurden 14 häufig in der konventionellen Landwirtschaft eingesetzte Pflanzenschutzmittel in 0,1-, 1- und 10-facher MRL-Konzentration, in Bezug auf essbare Gewebe von Rindern, untersucht. Weiterhin wurden sechs Kombinationen aus jeweils zwei Wirkstoffen ausgewählt. Im WST-1 (Water Soluble Tetrazolium 1) Assay wurden MDCKII-bABCG2-Zellen in aufsteigender Konzentration mit den Pflanzenschutzmitteln inkubiert (72 h) und die Zellvitalität ermittelt. Nach Inkubation der MDCKII-bABCG2- und MDCKII-Mock-Zellen mit den ausgewählten Pflanzenschutzmitteln oder den Kombinationen (4 h) wurde der Hoechst 33342-Akkumulationsassay durchgeführt. Dabei führt eine Interaktion des Pflanzenschutzmittels mit dem bABCG2-Transporter zu einer intrazellulären Anreicherung des Hoechst 33342-Farbstoffes. Für die Identifikation signifikanter Unterschiede wurden jeweils mindestens zwölf Monolayer auf Normalverteilung (Shapiro-Wilk-Test) überprüft und eine Einweg-Varianzanalyse mit Holm-Šidák post hoc Test (p ≤ 0,05) durchgeführt.
Ergebnisse
Nachdem eine Beeinträchtigung der Zellvitalität durch die ausgewählten Pflanzenschutzmittel in 0,1- bis 10-facher MRL-Konzentration ausgeschlossen wurde, konnte im Hoechst 33342-Assay für Chlorpyrifos-methyl und Tebuconazol ab 0,1-facher MRL-Konzentration eine signifikante Zunahme der intrazellulären Hoechst 33342-Gehalte im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle nachgewiesen werden. Für Diflufenican, Glyphosat, Methiocarb, Prochloraz, Rimsulfuron sowie Thiacloprid konnte in 1- und 10-facher MRL-Konzentration und für Iprodion sowie Ioxynil in 10-facher MRL-Konzentration eine signifikant erhöhte Hoechst 33342-Anreicherung detektiert werden. Darüber hinaus führte eine gleichzeitige Applikation von Methiocarb und Chlorpyrifos-methyl in 1-facher MRL-Konzentration, sowie von Glyphosat und Rimsulfuron in 10-facher MRL-Konzentration zu einer synergistischen Steigerung der Farbstoffakkumulation.
Schlussfolgerung
Es konnte festgestellt werden, dass das MDCKII-Zellmodell in Kombination mit dem Hoechst 33342-Assay eine valide Methode darstellt, um Wechselwirkungen einzelner und kombinierter Pflanzenschutzmittel zu detektieren. Insgesamt konnten unterhalb gesetzlich festgelegter MRL-Werte acht Pflanzenschutzmittel als potentielle bABCG2-Substrate identifiziert, sowie additive Effekte von Wirkstoffkombinationen nachgewiesen werden. Durch die Aufnahme von Pflanzenschutzmitteln mit dem Futter könnten diese aktiv in die Milch sezerniert werden und somit eine Gefahr für den Verbraucher darstellen:1 Einleitung 1
2 Literaturübersicht 4
2.1 Überblick über Membrantransporter 4
2.2 ABCG2-Effluxtransporter 5
2.2.1 Überblick 5
2.2.2 Struktur 6
2.2.3 ABCG2-Transportmechanismus 8
2.2.4 Spezifität der ABCG2-Substrate und Inhibitoren 9
2.2.5 Gewebeexpression 11
2.2.6 Bedeutung 12
2.2.7 Regulation der ABCG2-Transportaktivität 14
2.3 Fremdstoffsekretion der bovinen Milchdrüse 16
2.3.1 Funktionelle Anatomie 16
2.3.2 Transportmechanismen 16
2.3.3 Fremdstofftransporter 17
2.3.4 Bedeutung des ABCG2-Transporters 19
2.4 Pestizide 20
2.4.1 Überblick 20
2.4.2 Einsatz von Pflanzenschutzmitteln 21
2.4.3 Rechtliche Regelungen 21
2.4.4 MRL-Wert-Festsetzung von Pestiziden 22
2.4.5 Exposition des Verbrauchers 23
2.4.6 Gesundheitliche Risiken 24
2.4.7 Pestizide als endokrine Disruptoren 25
2.4.8 Mehrfachrückstände 26
2.4.9 Risikobewertung von Mehrfachrückständen 27
2.5 Problemstellung und Zielsetzung 29
3 Material und Methoden 30
3.1 Material 30
3.1.1 Pestizide 30
3.1.2 Chemikalien 32
3.1.3 Kit 32
3.1.4 Puffer und Lösungen 32
3.1.5 Zellkultur 33
3.1.6 Geräte 34
3.2 Methoden 35
3.2.1 Allgemeine zellbiologische Methoden 35
3.2.1.1 Kultivierung 35
3.2.1.2 Passagieren 35
3.2.1.3 Bestimmung der Zellzahl 35
3.2.1.4 Kryokonservierung 36
3.2.2 Bestimmung der Zellvitalität mittels WST-1 Zytotoxizitätstest 36
3.2.3 Quantitative Proteinbestimmung mittels BCA-Assay 38
3.2.4 Ermittlung von Interaktionen am bABCG2-Transporter 38
3.2.4.1 Aussaat und Vorbehandlung 39
3.2.4.2 Durchführung des Hoechst 33342-Assays 40
3.2.5 Detektion von Pestizidwechselwirkungen am bABCG2-Transporter 41
3.3 Statistik 42
4 Ergebnisse 43
4.1 Auswahl der Pestizide und ihrer Konzentrationen 43
4.2 Auswahl der Pestizidkombinationen 46
4.3 Einfluss der Pestizide auf die Zellvitalität 48
4.4 Interaktionen von Pestiziden am bABCG2-Transporter 53
4.5 Pestizidwechselwirkungen am bABCG2-Transporter 56
5 Diskussion 60
5.1 Zellmodell 60
5.2 Zellvitalitätsstudien in MDCKII-bABCG2-Zellen 61
5.3 Pestizide als potentielle bABCG2-Substrate 64
5.4 Wechselwirkungen von Pestiziden am bABCG2-Transporter 75
5.5 Risiken potentieller bABCG2-Substrate 79
6 Zusammenfassung 80
7 Summary 82
8 Literaturverzeichnis 84
9 Anhang 106
10 Danksagung 111
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:34151 |
| Date | 05 June 2019 |
| Creators | Kuhnert, Lydia |
| Contributors | Honscha, Walther, Kietzmann, Manfred, Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/acceptedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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