L’avènement de la microscopie biphotonique et des techniques dites de « super-résolution » ont permis d’améliorer les performances de la microscopie de fluorescence et de l’appliquer à l’imagerie intravitale et à l’analyse des tissus biologiques. Ces techniques requièrent néanmoins l’emploi de sondes aux propriétés optiques et biologiques optimisées.Plusieurs séries de colorants cationiques basés sur le motif vinyl-triphénylamine (TP) ont été développés pour le marquage d’ADN. Ces fluorophores rouges ou jaunes dont l’émission de fluorescence est commutée par l’interaction avec l’ADN sont des ligands de petit sillon de l’hélice B et possèdent des sections efficaces d’absorption à deux photons élevées.Les TP marquent l’ADN du noyau des cellules fixées ou en apoptose avec une intensité et un contraste élevés. Elles sont non-cytotoxiques, photostables et sont perméables à la membrane cellulaire. L’optimisation des propriétés a permis d’obtenir la TP-2Bzim, qui possède une brillance biphotonique parmi les plus élevées rapportées dans la littérature pour des molécules de faible poids moléculaire (383 GM) et permet une détection en microscopie biphotonique à basse concentration et à faible puissance d’excitation. En cellules vivantes, les TP sont localisées dans les mitochondries mais, sous excitation mono- ou bi-photonique constante, elles déclenchent l’apoptose de la cellule et se relocalisent dans le noyau. Le phénomène peut être imagé par fluorescence, et les TP pourraient donc être employées comme photosensibilisateurs théranostiques.Enfin, une stratégie de synthèse pour fonctionnaliser la TP-2Bzim a été développée. Elle a ainsi pu être couplée à des oligonucléotides et à un PNA pour la détection d’hybridation par fluorescence et à l’acide folique et à la spermidine pour le ciblage de cellules cancéreuses. / Significant advances were made in the field of in vivo fluorescence imaging thanks to the recent development of biphotonic microscopy and super-resolution techniques, rendering intravital imaging and biological tissues analysis possible. Those techniques however require the use of new probes with optimized optical and biological properties.Several series of cationic dyes for DNA staining were developed based on the vinyl-triphenylamine (TP) scaffold. Those new switchable yellow or red fluorophores bind in the minor-groove of DNA and display high two-photon absorption cross-sections. Two anionic derivatives were also designed for staining HSA.In fixed or apoptotic cells, the cationic dyes stain nuclear DNA with a high brightness and contrast. They are non-cytotoxic, photostable and cell permeant. The molecule with the most optimized properties, TP-2Bzim, has one of the highest two-photon brightness to date (383 GM in DNA), allowing sensible detection in biphotonic microscopy at low concentration and excitation power. In live cells, the dyes are localized in the mitochondria, but it appears that upon constant mono- or bi-photonic excitation they trigger cell apoptosis within a few minutes and are released in the nucleus. Since the phenomenon can be imaged by fluorescence microscopy, the TP dyes could thus be used as photosensitizers for theranostics.A synthetic pathway was also developed to functionalize the TP-2Bzim. It was then coupled by “click-chemistry” to short oligonucleotides or PNA sequences for fluorescence in situ hybridization, and to folic acid and spermidine for cancer cells targeting.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2012PA112319 |
| Date | 07 December 2012 |
| Creators | Dumat, Blaise |
| Contributors | Paris 11, Mahuteau-Betzer, Florence, Teulade-Fichou, Marie-Paule |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image, StillImage |
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