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Previous issue date: 2014-05-06 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, Brasil / Os métodos de diagnóstico usados hoje para a Doença de Chagas, embora simples e de baixo custo, podem apresentar baixas sensibilidade e especificidade ou reações cruzadas com outros patógenos. Da mesma forma, os medicamentos usados no tratamento apresentam severos efeitos colaterais. Dentre os vários alvos metabólicos sugeridos, as proteases têm sido apontadas como moléculas candidatas devido às suas particularidades. Recentemente o nosso grupo identificou duas aspartil proteases em T. Cruzi: uma solúvel (Cruzipsina-II) e outra membranar (Cruzipsina-I); entretanto, suas funções biológicas permaneceram desconhecidas. Os nossos resultados demonstram, pela primeira vez, a existência de um complexo proteolítico membranar em T. Cruzi com propriedades similares ao complexo \03B3-secretase de outras células eucarióticas. Usando ferramentas de bioinformática localizamos em banco de dados as sequências primárias de 3 das 4 proteínas do complexo (presenilina, nicastrina e Aph-1). Esta informação foi importante para caracterizarmos através de síntese paralela de peptídeos os epitopos B lineares das 3 proteínas usando soros de pacientes. A presenilina apresentou 10 epitopos majoritários, a nicastrina, 5 e a Aph-1, 10. Alguns epitopos foram selecionados por vários critérios e anticorpos anti-peptídeos obtidos em coelhos. O soro anti-peptídeo PRE-2 de presenilina identificou por immunoblotting a banda de 48kDa na fração CZP-I como sendo presenilina, enquanto o soro anti-peptídeo NIC-1 de nicastrina apresentou também uma marcação na mesma posição
A análise por microscopia confocal em epimastigotas localizou as proteínas predominantemente nas regiões anterior e mediana das células. Além disso, as marcações mostraram-se mais fortes em células permeabilizadas, sugerindo a co-localização de ambas as proteínas nas membranas internas da célula. Um teste de ELISA empregando 4 peptídeos sintéticos da presenilina e nicastrina de T. Cruzi apresentou sensibilidade e especificidade de 71,59% e 70,53%, respectivamente. Utilizando a extração diferencial com detergente e análise por EGPA-SDS após cromatografia de afinidade, confirmamos na cepa CL Brener de T. Cruzi o perfil de bandas presentes na cepa Y, de 240, 56, 48 e 34 kDa na fração CZP-I (detergente) e 56, 52, 37 e 34 kDa na fração CZP-II (solúvel). Ensaios enzimáticos usando o inibidor L-685,458 e moduladores alostéricos DAPT e Composto XXI/E da presenilina humana sugeriram que aparentemente o sítio catalítico da presenilina de T. Cruzi possui uma constituição semelhante ao da presenilina humana, enquanto diferenças significativas puderam ser observadas no sítio alostérico. O inibidor de sítio ativo L-685,458 foi capaz de inibir 100% da atividade enzimática em 5\03BCM, enquanto os moduladores DAPT e Composto XXI/E não apresentaram uma inibição significativa. Portanto, os nossos estudos sugerem que devido as suas funções enzimáticas e localização celular a presenilina do T. Cruzi é um bom alvo quimioterapêutico e imunológico / The diagnostic methods used today for Chagas disease, although simple and
may present low sensitivity and specificity or cross
drugs used nowadays to treat
metabolic targets suggested, proteases have been identified as candidate molecules due to its
particularities. Recently our group identified two aspartyl proteases in
(Cruzipsin-II) and a membrane
remained unknown. Our results demonstrat
proteolytic complex in T. cruzi
eukaryotic cells. Using bioinformatics tools
proteins (presenilin, nicastrin and Aph
information was important for parallel synthesis of peptides
epitopes of proteins using sera from eight patients. P
nicastrina, 5 and Aph-1, 10. Some epitopes we
sera were obtained in rabbits. Serum
immunoblotting a 48 kDa band in fraction CZP
of nicastrin also presented a marking in the same position.
of epimastigotes localized
addition, the markings were
localization of both proteins in the inner membranes of the cell. An ELISA employ
synthetic peptides for T. cruzi
specificity and 70.53%. Using
after affinity chromatography confirm
were like those of strain Y:
37 and 34 kDa in CZP-II fraction (soluble
allosteric modulators DAPT and Compound XXI/E
that the catalytic site of T. cruzi
while significant differences were observed in the allosteric site. T
685,458 was able to inhibit 100% of enzyme activity at 5
and Compound XXI/E showed no significant inhibition. Therefore, our studies suggest that
due to their enzymatic funct
target for chemotherapeutic and
cross-reactions with other pathogens. Likewise,
Chagas disease show severe side effects. Among the various
membrane-bound (Cruzipsin-I); however, their
demonstrate for the 1st time, the existence of a
with similar properties to the -secretase
tools, the primary sequences of three of four complex
Aph-1) where localized at a protein database.
and the identi
Presenilin presented
were selected by different criteria and anti
anti-peptide PRE-2 of presenelin
CZP-I as presenelin, while the anti
Analysis by confocal microscopy
the proteins mainly at anterior and middle portions of th
found to be stronger in permeabilized cells, suggesting co
presenilin and nicastrin presented sensitivity
. differential detergent extraction and analysis by SDS
confirmed that the profile bands present in the strain CL Brener
240, 56, 48 and 34 kDa in fraction CZP-I (detergent), and 56, 52,
soluble). Enzyme assays using the inhibitor L
APT of human presenilin apparently suggested
presenilin has a constitution similar to the human presenilin,
The active site inhibitor
458 M, while the modulator
functions and cellular localization the presenilin
for immune system.
unexpensive,
T. cruzi: a soluble
biological functions
membrane
complex of other
This
identification of linear
10 major epitopes,
re anti-peptide
identified by
, anti-peptide NIC-1
the cells. In
colocalization
employing four
of 71.59% and
SDS-PAGE
says L-685,458 and
he LM,
modulators DAPT
of T. cruzi is a good target for chemotherapeutic and for immune system.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/7701 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Gruszkowski, Carolina Conceição Bottino |
| Contributors | Pinho, Rosa Teixeira, Bourguignon, Saulo Cabral, Habib, Elvira Maria S. C. Bou, Guedes, Maria Izabel Florindo, Lopez, Raquel Elisa da Silva, Simone, Salvatore Giovanni de |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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