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Previous issue date: 2009-08-03 / The silver mojarra (Diapterus rhombeus) is specie of relevant representation among the fishing community in northeastern Brazil. Also in this region, the fishing is the most representative records despite growing carapeba in extensive systems. Among the parts of the fish are not consumed are the viscera which represent 5% of the total weight of the animals. Thus, to be discarded without treatment, these wastes pose serious environmental problem. However, because they are rich in digestive enzymes, viable for use in certain biotechnological processes these viscera represent an important alternative source of industrial enzymes. Based on this information, the purpose of this study was to purify and characterize an alkaline protease from the viscera of D. rhombeus. Therefore, viscera silver mojarra were used to obtain a crude extract and thereafter used for enzyme purification. The purification process was carried out in three steps: heat treatment (45°C for 30 minutes), precipitation with ammonium sulfate and molecular exclusion chromatography (Sephadex G-75). At the end of the purification process, achieved an increase of 86.80-fold in the specific activity and a yield of 22.34%. An aliquot of purified extract was applied to gel electrophoresis (SDS-PAGE) and its molecular weight was estimated at 24.5 kDa. The optimum pH and optimum temperature for enzyme activity were 8.5 and 55°C, respectively. The enzyme was shown to be sensitive to temperatures above 45°C, after incubation for 30 min, losing 100% of its activity. The values of Km and Kcat of the protease were 0.266 mM and 0.116 mM-1 s-1, respectively, using benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide (BAPNA) as substrate. Its activity was increased in the presence of ions K+, Li+, Ca2+, Mn2+ and Ba2+ ions and inhibited by Fe2+, Cd2+, Cu2+, Al3+, Hg2+, Zn2+ and Pb2+. Tests with protease inhibitors showed that the enzyme was strongly inhibited by TLCK and benzamidine, classic inhibitors of trypsin. The sequence of the first 15 amino acid N-terminal protease was IVGGYECTMHSEAHE and showed high homology with trypsins of various species of fish. The data show that the purified enzyme is one trypsin-like with characteristics compatible to be used in the biotechnology industry. / A Carapeba prateada (Diapterus rhombeus) é uma espécie de relevante representatividade dentre a comunidade pesqueira da região nordeste do Brasil. Ainda nessa região, a pesca artesanal é a mais representativa apesar de registros de cultivo da carapeba em sistemas extensivos. Dentre as partes do peixe não consumidas encontramse as vísceras que correspondem a 5% do peso total dos animais. Desta forma, ao serem descartadas, sem tratamento, esses resíduos representam grave problema ambiental. Entretanto, por serem ricas em enzimas digestivas, viáveis para utilização em determinados processos biotecnológicos essas vísceras representam uma importante fonte alternativa de enzimas industriais. Visando essas informações, o objetivo do presente trabalho foi purificar e caracterizar uma protease alcalina das vísceras de D. rhombeus. Para tanto, vísceras de carapeba prateada foram utilizadas para obtenção de um extrato bruto posteriormente utilizado para purificação enzimática. O processo de purificação foi realizado em três etapas: tratamento térmico (45oC por 30min), precipitação com sulfato de amônio e cromatografia de exclusão molecular (Sephadex G-75). Ao final do processo de purificação obteve-se um incremento de 86,80 vezes na atividade específica e um rendimento de 22,34%. Uma alíquota do extrato purificado foi aplicada em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e o seu peso foi estimado em 24,5 kDa. O pH ótimo e a temperatura ótima para a atividade enzimática foram 8,5 e 55 °C, respectivamente. A enzima demonstrou ser sensível a temperaturas superiores a 45 ºC, após incubação por 30 min, perdendo 100% de sua atividade. Os valores de Km e do Kcat da protease foram 0,266 mM e 0,116 s-1 μM -1, respectivamente, usando benzoil-DLarginina- p-nitroanilida (BAPNA) como substrato. Sua atividade foi aumentada na presença dos íons K+, Li+, Ca2+, Mn2+ e Ba2+ e inibidas pelos íons Fe2+, Cd2+, Cu2+, Al3+, Hg2+, Zn2+ e Pb2+. Testes com inibidores de proteases mostraram que a enzima foi fortemente inibida por TLCK e benzamidina, inibidores clássicos de tripsina. A sequência dos 15 primeiros aminoácidos do N-terminal da protease foi IVGGYECTMHSEAHE e mostrou alta homologia com tripsinas de diversas espécies de peixes. Os dados obtidos demonstram que enzima purificada é uma tripsina com características compatíveis para ser empregada na indústria biotecnológica.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede2:tede2/6337 |
| Date | 03 August 2009 |
| Creators | SILVA, Janilson Felix da |
| Contributors | BEZERRA, Ranilson de Souza, CAVALLI, Ronaldo Olivera, RIBEIRO, Karina, CASTRO, Patrícia Fernandes de |
| Publisher | Universidade Federal Rural de Pernambuco, Programa de Pós-Graduação em Recursos Pesqueiros e Aquicultura, UFRPE, Brasil, Departamento de Pesca e Aquicultura |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRPE, instname:Universidade Federal Rural de Pernambuco, instacron:UFRPE |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 8021741564034322547, 600, 600, 600, 7231936942857037408, -6131750198709519811 |
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