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Previous issue date: 2007-02-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The major incidence and the high level of mortality associated to the huge diversity of the cancer phenotypic require numerous strategies for its diagnosis. In this research, the aim was to evaluate the mutation relation in the gene Tp53 with the breast cancer in female dogs, through the immunohistochemistry expression of the protein p53 and of the gene polymorphism in the breast tissues. In the Experiment 1, was studied the immunohistochemistry expression of the protein p53 in relationship to the morphologic aspects of healthy mammary tissues, to classification and grade of tumors and to the ipsilateral inguinal lymph-nodes tissue, metastatic or not. For this purpose 19 breasts from healthy female dogs were used (Group 1- control), 29 samples of breasts with clinical diagnosis of tumor (Group 2), 29 contralateral breasts (Group 3) and 29 lymphnodes (Group 4). The material was analyzed by conventional techniques of microscopy (staining HE) for tissue’s characterization and by immunohistochemistry (estreptavidina-biotina peroxidase method) to evaluate the expression of the protein p53 in the cellular compartment. The contralateral breasts and the lymph-nodes that showed metastasis were also marked, as well as the tissues that still showed normality. There weren´t statistical differences between the staining intensity and the number of cells stained with malignity grade. In the Experiment 2 the aim was to detect mutations in sequences of the exon 8 of the gene Tp53 through the PCR-RFLP technique with specific restriction enzymes to associate with band patterns obtained to the breast tumor type or normal tissues in female dogs. Were used 19 healthy female dogs (control) and 50 female dogs submitted to the tumor exerese from wich samples of tumor tissue and of healthy contralateral mammary glands were obtained. The DNA extraction was done through the fenol-cloroformic method and the PCR-RFLP technique was used for amplifiation and digestion of the exon 8 of the Tp53 with 6 restriction endonucleases, SmaI, DdeI, Rsa, AvaI, BsobI e AluI. The amplified DNA showed only one side of 200 pb in the agarose gel (0,8%). The PCR product showed on average 94% of homology with the known sequence of the gene (GeneBank –AAB42022.1). Among the 6 chosen enzymes, only 4 showed polymorphism (AluI, BsobI, DdeI e SmaI) in the tumor sequence of the exon 8 as to the numbers of pairs of the base (pb) or the quantity of cleavages. The band patterns of each enzyme showed polymorphism among the different groups, but not inside each group (normal female dogs, tumor mammary glands and contralateral breasts). There was´nt any difference among the breast tissues with tumor and the opposite laterals of the same animal, for the enzymes AluI, BsoBI e SmaI, reinforcing the idea that the tissues that didn´t showed visible alterations were already changed at the molecular level and therefore were potentially capable of developing tumors over the time. It is concluded that the gene Tp53 is strongly involved in the breast cancer etiology, and it could be used as a parameter to analyse these tumors´ behavior. The analysis of the protein p53 expression associated to the genetic markers that identify the mutations in the gene sequence could propitiate the early diagnosis of this pathology, allowing the treatment in time of avoiding metastasis and risks of the animal´s survival. / A incidência e o nível de mortalidade associada a diversidade dos fenótipos de câncer requerem estratégias para seu diagnóstico. Neste trabalho, objetivou-se avaliar a relação das mutações no gene Tp53 com o câncer de mama em cadelas, através da expressão imunoistoquímica da proteína p53 e do polimorfismo do gene nos tecidos mamários. No Experimento 1 foi verificada a expressão imunoistoquímica da proteína p53 associando-a ao aspecto morfológico de tecido glandular mamário sadio, a classificação e gradação dos tumores mamários e ao tecido linfonodal inguinal ipsilateral, (com ou sem metástase). Para isso foram utilizadas 19 mamas normais (Grupo 1 - controle), 29 amostras de mamas com diagnóstico clínico de tumor (Grupo 2), 29 mamas contra laterais (Grupo 3) e 29 linfonodos (Grupo 4). O material foi analisado por técnicas convencionais de microscopia (coloração HE) para caracterização dos tecidos e por imunoistoquímica (método da estreptavidina-biotina peroxidase) para avaliar a expressão da proteína p53 nos compartimentos celulares. As mamas do Grupo 2, pela análise histopatológica, apresentaram 65,52% de tumores malignos e 13,79% de tumores benignos. Foram observadas metástases em 6,9% das mamas contra laterais (Grupo 3) e em 31,03% dos linfonodos (Grupo 4). A marcação imunoistoquímica, para expressão de p53, não foi observada em tecidos de animais normais, mas foi evidente tanto em células de tumores malignos quanto benignos localizando-se no núcleo, no citoplasma ou em ambos compartimentos celulares. As mamas contra laterais e os linfonodos que apresentaram metástase também foram marcados, bem como tecidos que ainda apresentavam padrão de normalidade. Não houve diferenças estatísticas entre a intensidade da marcação e do número de células marcadas com o grau de malignidade. No Experimento 2, o objetivo foi detectar mutações em seqüências do exon 8 do gene Tp53 através da técnica PCR-RFLP com enzimas específicas de restrição para associar o padrão de bandas obtidas ao tipo de tumor de mama ou tecido de glândula mamária normal de cadelas. Foram utilizadas 19 cadelas sadias (controle) e 50 cadelas submetidas à retirada de tumor das quais foram obtidas amostras dos tecidos tumorais e de glândulas mamárias sadias contra laterais. A extração de DNA foi realizada pela técnica de fenol-clorofórmio e a PCR-RFLP foi utilizada para amplificação e digestão do exon 8 do Tp53 com 6 endonucleases de restrição, SmaI, DdeI, Rsa, AvaI, BsobI e AluI. O DNA amplificado apresentou uma única banda de 200 pb no gel de agarose 0,8%. O produto de PCR apresentou em média 94% de homologia com a seqüência conhecida do gene (GeneBank –AAB42022.1). Das 6 enzimas selecionadas, apenas 4 apresentaram polimorfismo (AluI, BsobI, DdeI e SmaI) na seqüência do exón 8 do tumor quanto ao número dos pares de base nucleotídeos (pb) ou quantidade de clivagens. O padrão das bandas de cada enzima apresentou polimorfismo entre os grupos diferentes, mas não dentro do seu grupo (cadelas normais, glândulas mamárias com tumor e mama contra lateral ao tumor). Não houve diferença entre os tecidos de mamas com tumor e as contra laterais do mesmo animal, para as enzimas AluI, BsoBI e SmaI, reforçando a idéia de que os tecidos que ainda não apresentam alteração visível, já se encontram alterados no nível molecular e portanto são potencialmente capazes de desenvolver tumores ao longo do tempo.Conclui-se que o gene Tp53 está fortemente envolvido na etiologia das neoplasias de mamas em cadelas, podendo ser utilizado como parâmetro para analisar o comportamento destes tumores. A análise da expressão da proteína p53 associada a marcadores genéticos que identificam mutações na seqüência do gene, pode propiciar o marcadores genéticos que identificam mutações na seqüência do gene, pode propiciar o diagnóstico precoce da patologia, permitindo o tratamento em tempo de evitar metástases.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede2:tede2/5756 |
| Date | 14 February 2007 |
| Creators | TEIXEIRA, Maria Juliana Coelho Dias da Silva |
| Contributors | WISCHRAL, Aurea, GOMES FILHO, Manoel Adrião, SOBRAL, Ana Paula Veras, SILVA, Márcia Bezerra da, CASSALI, Geovanni Dantas, SÁ, Marcelo Jorge Cavalcante |
| Publisher | Universidade Federal Rural de Pernambuco, Programa de Pós-Graduação em Ciência Veterinária, UFRPE, Brasil, Departamento de Medicina Veterinária |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRPE, instname:Universidade Federal Rural de Pernambuco, instacron:UFRPE |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | -3061482854177903105, 600, 600, 600, 600, -3020210563763616780, 453670264235017319, 2075167498588264571 |
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