Fehlgefaltete Proteine des sekretorischen Weges werden aus dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) in das Zytosol transportiert und dort durch das Ubiquitin-Proteasom-System abgebaut. Dieser Qualitätskontrollmechanismus wird als Endoplasmatisches Retikulum-assoziierte Proteindegradation bezeichnet (ERAD). In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae stellt die HRD-Ubiquitinligase eine zentrale Komponente dieses Abbausystems dar. Eine Untereinheit dieses Multienzymkomplexes ist das ER-ständige Membranprotein Der1, das über den Faktor Usa1 an die Ubiquitinligase Hrd1 rekrutiert wird und ausschließlich für den Abbau löslicher luminaler ERAD-Substrate notwendig ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der C-Terminus von Der1 die Interaktion zu Usa1 und damit die Rekrutierung des Proteins zur HRD-Ligase vermittelt. Usa1 wirkt nicht nur als Rekrutierungsfaktor, sondern induziert auch die Der1-Oligomerisierung. Punktmutationen in den Transmembrandomänen von Der1 beeinträchtigen die Dislokation luminaler Substratproteine aus dem ER. Um weitere Hinweise für eine Beteiligung von Der1 beim Substrattransport zu erhalten, wurde die Methode des zielgerichtetem in vivo photocrosslinking für Der1 angewendet. Hierbei wurden bestimmte Positionen von Der1 mit dem photoreaktiven Aminosäureanalogon p-Benzoylphenylalanin markiert, was die Ausbildung von Quervernetzungen von Der1 zu Interaktionspartnern nach einer UV-Bestrahlung ermöglichte. Schließlich konnte auf diese Weise eine räumliche Nähe der luminal exponierten Bereiche von Der1 zum Substratrezeptor Hrd3 gezeigt werden, während die Transmembransegmente Quervernetzungen zu Hrd1 ausbildeten. Beide Bereiche von Der1 konnten zudem mit einem luminalen ERAD-Substrat quervernetzt werden. Anhand dieser Ergebnisse wurde somit erstmals eine direkte Beteiligung von Der1 insbesondere in den ersten Schritten der Substratdislokation gezeigt, was eine Funktion von Der1 als zentrale Komponente des Exportkomplexes nahelegt. / Newly synthesized proteins of the secretory pathway are subjected to an efficient quality control system in the endoplasmic reticulum. In order to prevent a harmful aggregation misfolded proteins are exported via a largely unknown mechanism into the cytosol and degraded by the ubiquitin-proteasome system in a process termed ER associated degradation (ERAD). In the yeast Saccharomyces cerevisiae the HRD-ligase constitutes a central component of ERAD. A subunit of this multi-enzyme complex is the small multispanning membrane protein Der1, which is exclusively required for the degradation of misfolded ER luminal proteins but dispensable for the turnover of membrane-bound substrates. In this study a short conserved motif in the cytosolic carboxyterminus of Der1 was identified that mediates the binding to the HRD-ligase. Moreover, co-immunoprecipitation experiments show that Der1 forms oligomers, which relies on its assembly into the degradation complex. Mutations in the transmembrane domains of Der1 block the export of soluble proteins across the ER-membrane. To further investigate the function of Der1 in substrate dislocation an in vivo site-specific photocrosslinking approach was applied. Various positions of Der1 were labelled with the photoreactive amino acid analogue p-benzoyl-phenylalanine followed by UV irradiation of living cells expressing these Der1 constructs. The crosslinking experiments reveal a spatial proximity of ER luminal exposed parts of Der1 to the substrate receptor Hrd3. By contrast, the membrane-embedded domains of Der1 reside adjacent to the ubiquitin ligase Hrd1. Intriguingly, both regions also form crosslinks to a client protein. In summary the data of this work imply that multimeric Der1 initiates the export of aberrant polypeptides from the ER-lumen by threading such molecules into the ER-membrane and routing them to Hrd1 for ubiquitylation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/17390 |
| Date | 13 May 2013 |
| Creators | Mehnert, Martin |
| Contributors | Sommer, Thomas, Heinemann, Udo, Hoppe, Thorsten |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | German |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | Namensnennung - Keine kommerzielle Nutzung - Keine Bearbeitung, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/ |
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