The ubiquitination of proteins controls a multitude of physiological processes. This versatility of ubiquitin as a molecular signal arises from the diverse ways by which it can be attached to target proteins. Different ubiquitination patterns are then translated into different downstream consequences. Due to the enormous complexity of possible ubiquitin modifications, the ubiquitination machinery must be highly specific and tightly controlled. Ubiquitination proceeds through an enzymatic cascade, the last step of which is catalyzed by the E3 enzyme family. E3 enzymes are the crucial regulators since they dictate the specificity of substrate selection and modification.
Deregulation of the HECT-type ubiquitin ligase E6AP (UBE3A) is implicated in human papilloma virus-induced cervical tumorigenesis and several neurodevelopmental disorders. Yet the structural underpinnings of activity, regulation and specificity in this crucial ligase are incompletely understood.
One aim of this study was to unravel the role of the a1’-helix N-terminal to the HECT domain that was found to be a key element mediating regulation and oligomerization in other HECT ligases. I found that most N-terminally extended HECT domain constructs were insoluble when expressed in E. coli, indicating that additional regions N-terminal to the tested fragments may be essential to protect this highly hydrophobic helix from causing aggregation.
Another question addressed in this study was how E6AP builds ubiquitin chains. Using single-turnover experiments, I showed that ubiquitin-loaded E6AP is unable to transfer an additional ubiquitin molecule onto a stably linked ubiquitin-E6AP complex. This indicates that E6AP cannot assemble chains on its active site and may instead follow a sequential addition mechanism in which one ubiquitin molecule is transferred at a time to the target protein.
Using NMR spectroscopy and extensive mutational analyses, the determinants of ubiquitin recognition by the C-lobe of E6AP were unraveled and assigned to particular steps in the catalytic cycle. A functionally critical interface was identified that is specifically required during thioester formation between the C-terminus of ubiquitin and the ligase active site. This interface resembles the one utilized by NEDD4-type enzymes, suggesting a conserved ubiquitin binding mode across HECT ligases, independent of their linkage specificities. Moreover, I identified critical surface patches on ubiquitin and in the N- and C-terminal portions of the catalytic domain of E6AP that are important for the subsequent step of isopeptide bond formation. I also uncovered key determinants of the Lys48-linkage specificity of E6AP, both in the E6AP HECT domain and ubiquitin itself. This includes the C-terminal tail of E6AP and a hydrophilic surface region of ubiquitin in proximity to the acceptor site, Lys48. It is thus tempting to speculate that ubiquitin linkage formation by E6AP is substrate-assisted. Taken together, my results improve our mechanistic understanding of the structure-function relationship between E6AP and ubiquitin, thus providing a basis for ultimately manipulating the functions of this HECT ligase for therapeutic applications. / Die Ubiquitinierung von Proteinen ist an nahezu jedem physiologischen Prozess beteiligt. Die Vielseitigkeit mit der Ubiquitin als molekulares Signal fungiert, rührt von den vielfältigen Möglichkeiten her, wie es an Zielproteine gebunden werden kann. Verschiedene Ubiquitinierungsmuster rufen unterschiedliche biologische Ereignisse hervor. Angesichts der enormen Komplexität möglicher Ubiquitinierungsmodifikationen muss die Ubiquitinierungs-maschinerie hochspezifisch und streng kontrolliert sein. Die Ubiquitinierung erfolgt über eine enzymatische Kaskade. Der letzte Schritt wird hierbei durch die Enzymfamilie der Ubiquitin-Ligasen katalysiert. Ubiquitin-Ligasen sind primär für die Spezifität in Substraterkennung und Ubiquitin-Kettenbildung verantwortlich.
Misregulation der HECT-Ligase E6AP fördert die durch humane Papillomaviren induzierte Tumorentwicklung im Gebärmutterhals und ist mit zwei schweren neurologischen Krankheiten verbunden. Strukturelle Einzelheiten über den Mechanismus, die Regulation und die Spezifität dieser wichtigen Ligase sind jedoch weitgehend unbekannt.
Für verschiedene HECT-Ligasen wurde gezeigt, dass die a1‘-Helix N-terminal zur HECT-Domäne ein Schlüsselelement für die Regulation und den Oligomerisierungszustand der Enzyme darstellt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Helix eine wichtige Funktion für die Stabilität von E6AP erfüllt. Der Großteil N-terminal verlängerter, in E. coli exprimierter HECT-Domänen-Konstrukte war unlöslich, was darauf hindeutet, dass N-terminal gelegene Regionen hydrophobe Bereiche des Proteins vor Aggregation schützen.
Eine weitere Fragestellung dieser Arbeit befasste sich mit dem Mechanismus der Ubiquitin-Kettenbildung durch E6AP. Mit ‘single-turnover‘-Experimenten konnte gezeigt werden, dass ein über einen Thioester gebundenes Ubiquitin von E6AP nicht auf einen stabil verknüpften Ubiquitin-E6AP-Komplex übertragen werden kann. Dies deutet daraufhin, dass E6AP keine Ketten auf dem katalytischen Cystein aufbauen kann und stattdessen einem sequentiellen Additionsmechanismus der Ubiquitin-Kettenbildung folgt.
Mithilfe von NMR Spektroskopie und umfangreicher Mutagenese-Studien wurde eine Interaktion zwischen dem C-Lobe von E6AP und Ubiquitin gefunden, die während der Thioesterbildung zwischen dem C-Terminus von Ubiquitin und dem aktiven Zentrum von E6AP gebraucht wird. Diese Interaktionsfläche ähnelt derer der NEDD4-Familie, was auf einen konservierten Bindungsmodus der HECT-Ligasen an Ubiquitin im ersten Reaktionsschritt hindeutet, ungeachtet der jeweiligen Kettenspezifitäten. Verschiedene Oberflächen auf Ubiquitin und E6AP, sowohl auf dem C-Lobe als auch auf dem N-Lobe, konnten identifiziert werden, die für die Bildung einer Isopeptidbindung zwischen zwei Ubiquitin-Molekülen von Bedeutung sind. Neben dem C-Terminus von E6AP wurde eine hydrophile Oberfläche auf Ubiquitin in unmittelbarer Nähe zum Akzeptor Lys48 gefunden, die wichtig für die Lys48-spezifische Ubiquitin-Kettenbildung ist. Der Gedanke liegt nahe, dass die Ubiquitin-Kettenbildung durch E6AP über Substratunterstützte Katalyse verläuft.
Zusammenfassend erweitern diese Ergebnisse maßgeblich unser Verständnis der Erkennung von Ubiquitin durch die HECT-Ligase E6AP und können möglicherweise dazu beitragen Wirkstoffe zu entwickeln, welche eine Fehlregulierung von E6AP ausgleichen können.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:17960 |
| Date | January 2020 |
| Creators | Ries, Lena Kerstin |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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