La transcriptase inverse (RT) est un hétéro-dimère p66/p51 avec des activités ADN polymérase et ribonucléase H qui jouent un rôle critique dans le cycle viral du VIH-1. La RT convertit l’ARN génomique viral simple brin en ADN proviral double brin dans le cytoplasme de la cellule infectée. L’efficacité de la RT est augmentée par la protéine de la nucléocapside (NC) grâce à son activité chaperonne vis-à-vis des acides nucléiques et/ou une coopération entre les deux protéines. Dans ce travail, nous avons étudié par la technique de smFRET (single molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer) les effets de la NC sur l’interaction entre la RT et un substrat d’ADN au niveau de deux sites de pause de la synthèse de l’ADN(+). Nous avons d’abord réalisé et validé le montage de smFRET. Lors de la validation du montage avec des fluorophores Cy3 encapsulés dans des vésicules lipidiques, nous avons mis en évidence deux mécanismes différents entrainant le photoblanchiment du Cy3. Ensuite, après avoir déterminé les propriétés de liaison à l’équilibre de la RT et la NC sur différents substrats amorce/matrice à l’aide de mesures d’ensemble en solution, nous avons confirmé par smFRET que la RT adopte plusieurs conformations sur son substrat d’ADN, incluant celle qui conduit à la polymérisation de l’ADN. En présence de la NC, nous n’avons observé qu’une réorganisation modérée des différentes conformations du complexe RT/substrat. Par contre, une réorganisation beaucoup plus importante est induite par la NC en présence du dNTP, avec une très forte exaltation des conformations compétentes pour la polymérisation. Nous avons également montré que la NC augmente l’efficacité de synthèse de l’ADN au niveau de sites de pause en diminuant ou en augmentant le temps de dissociation du complexe RT/substrat/dNTP selon le type de site de pause. L’ensemble de ces données permet de mieux comprendre les mécanismes polyvalents par lesquels NC facilite l’activité de la RT. / The reverse transcriptase (RT) is a p66/p51 hetero-dimer with DNA polymerase and ribonuclease H activities which plays a critical role in the viral cycle of HIV-1. RT converts the viral genomic RNA to proviral DNA in the cytoplasm of infected cells. The efficiency of RT is increased by the nucleocapsid protein (NC) through its nucleic acids chaperone properties and/or via direct interaction with RT. In the present work, we investigated the effects of NC on the interaction between RT and its DNA substrate attwo pause sites during the synthesis of (+)DNA by using the smFRET (single molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer) technique. In a first step, we implemented and validated the smFRET set-up. Within the validation step, using Cy3 fluorophores encapsulated, in lipid vesicles, we monitored the photobleaching of Cy3 dyes and found out that it was governed by two parallel mechanisms. In a second step, we determined the affinity of RT and NC to different primer/template substrates by using steady-state fluorescence. Then, we confirmed by smFRET that RT adopts different conformations on its DNA substrate, including the one that leads to DNA polymerization. In the presence of NC, we observed only a moderate reorganization of the different conformations of RT/substrate complex. However, NC was found to induce a more important reorganization in the presence of dNTP, with a very strong promotion of the polymerization-competent conformations. We also showed that NC increases the efficiency of DNA synthesis at pause sites by either decreasing or increasing the dissociation time of the RT/substrate/dNTP complex, depending on the type of pause site. Together, these data allow us to further elucidate the mechanisms by which NC facilitates the RT.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2013STRAJ023 |
| Date | 17 January 2013 |
| Creators | Jouonang, Armelle |
| Contributors | Strasbourg, Mély, Yves, Kenfack Assongo, Cyril |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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