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Previous issue date: 2016-02-23 / Streptococcus pneumoniae é um patógeno colonizador da nasofaringe de humanos sendo responsável pela maioria das pneumonias adquiridas na comunidade, além de causar diversas doenças não-invasivas e invasivas. As vacinas disponíveis atualmente são sorotipo específicas, além disso as conjugadas apresentam limitado espectro de ação e alto custo de produção, ao passo que as polissacarídicas apresentam baixa imunogenicidade em crianças menores de dois anos de idade e adultos maiores de 65 anos, grupos os quais se encontram em alto risco de adquirirem doenças pneumocócicas. Assim, a utilização de proteínas recombinantes, associadas à virulência, é uma alternativa para a composição de vacinas. Neste trabalho, empregando a vacinologia reversa, selecionamos 20 genes que codificam proteínas com predição para localização na superfície celular. Dentre os candidatos selecionados amplificamos, clonamos e expressamos 19 genes e purificamos 10 proteínas recombinantes na forma solúvel. A expressão e localização das proteínas na superfície dos pneumococos foram confirmadas por meio de citometria de fluxo e imunofluorescência indireta. Além disso, observamos que 4 das 10 proteínas de pneumococos foram capazes de interagir com proteínas de matriz extracelular, embora os anticorpos policlonais gerados contra as proteínas recombinantes não tenham sido capazes de inibir a adesão da bactéria às células eucarióticas A549. A antigenicidade das proteínas recombinantes de pneumococo foi avaliada frente a soros de pacientes com meningite pneumocócica e observamos que duas proteínas foram reconhecidas por mais de 50% dos soros avaliados
A presença e o grau de identidade dos genes selecionados em amostras de pneumococos de origem clínica foram avaliados por PCR e sequenciamento. Verificamos que a maioria dos genes está presente nas 51 amostras utilizadas neste estudo e demonstraram um alto grau de conservação nucleotídico e proteico entre as amostras de pneumococos, bem como em S. pseudopneumoniae, S. mitis e S. oralis, espécies que são altamente relacionadas geneticamente com os pneumococos. Assim, propomos que as proteínas 02232 (CbpE), 00080 (proteína ligadora de ATP/ABC transportadora), 00333 (componente permeásico/proteína ABC transportadora) e 01065 (histidina quinase) podem ser consideradas importantes alvos vacinais por serem expressas e expostas à superfície bacteriana e terem demonstrado interação com proteínas de matriz extracelular, podendo indicar algum papel destas proteínas no processo de adesão da bactéria às células do hospedeiro. Por outro lado não descartamos a possível importância das proteínas 02072 (PiuA) e 02009 (proteína hipotética) no processo de infecção de pneumococo, em virtude de essas proteínas terem sido reconhecidas por mais de 41% dos soros de pacientes / Streptococcus pneumoniae
is a colonizer of the human nasopharynx, which acc
ounts
for most of the community-acquired pneumonia cases
and can cause non-invasive and
invasive diseases. C
urrently available vaccines are serotype–specific;
conjugate vaccines
show a limited spectrum of action and high producti
on costs, while the polysaccharide
vaccine have low immunogenicity in children under t
wo years of age and adults over 65,
groups which are at high risk of acquiring pneumoco
ccal disease
. To overcome these
problems, the use of recombinant proteins, associat
ed with virulence, is an alternative to
compose vaccines. In this work, 20 proteins with po
sitive prediction for extracellular
localization were selected by reverse vaccinology.
A total of 19 genes were amplified, cloned
and expressed. Ten proteins were purified in a solu
ble form. The expression of the selected
proteins on the pneumococci cell surface was confir
med by
flow cytometry and
immunofluorescence.
Data showed that 4 proteins were able to interact
with extracellular
matrix proteins. However, polyclonal antibodies aga
inst the recombinant proteins were not
able to inhibit the pneumococci adhesion to A549 eu
karyotic cells. The protein antigenicity
was evaluated by immunoblotting using antisera from
patients with pneumococci meningitis
and two proteins were recognized in more than 50% o
f the serum samples. In order to
evaluate the identity degree of the selected genes,
PCR assays were carried out. Most of the
genes were present in all clinical isolates and sho
wed a high degree of nucleotide and amino
acid conservation between pneumococci samples, as w
ell as in
S. pseudopneumoniae
,
S. mitis
and
S. oralis
species. Thus, we propose that proteins 02232 (Cbp
E), 00080 (ABC transporter,
ATP-binding protein), 00333 (ABC-type antimicrobial
peptide transport system, permease
component) and 01065 (sensor histidine kinase, puta
tive) can be considered important vaccine
targets since they were expressed and exposed to th
e bacterial surface and demonstrate
interaction with extracellular matrix proteins, whi
ch may indicate a role of these proteins in
the process of adhesion of the bacteria to host cel
ls. However, proteins 02072 (PiuA) and
02009 (hypothetical protein) should also be conside
red for they were recognized by over 41%
of sera from patients and could be important in the
pneumococcal infection.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/13170 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Argondizzo, Ana Paula Corrêa |
| Contributors | Lima, Leila de Mendonça, Leite, Luciana Cezar de Cerqueira, Vicente, Ana Carolina Paulo, Teixeira, Lucia Martins, Miranda, Antonio Basílio de, Medeiros, Marco Alberto, Galler, Ricardo |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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