Resumo: O conteúdo total do veneno das aranhas do gênero Loxosceles permanece ainda desconhecido, entretanto, muitos estudos têm mostrado que se constitui uma mistura complexa de compostos biologicamente ativos. Por meio de análises eletroforéticas, observa-se a predominância de moléculas de baixa massa molecular (3-45 kDa), enquanto moléculas de alta massa molecular são menos abundantes. Os venenos de aranhas estão funcionalmente relacionados à defesa contra predadores e também à paralisia e captura de presas, especialmente insetos. As aranhas desenvolveram um arsenal de moléculas inseticidas, resultando em uma biblioteca combinatória de peptídeos que tem sido aprimorada durante sua evolução. Comumente, tais peptídeos consistem em moléculas de cadeia única com massa molecular variando de 3 a 10 kDa, ricos em resíduos de cisteína, os quais estabelecem pontes dissulfeto intramoleculares características. Essas pontes se organizam em um motivo estrutural característico denominado "nó de cistina inibidor" ou ICK (Inhibitor Cystine Knot) e, por isso, os peptídeos que o contém são denominados notinas ("knottins"). Recentemente, análises do transcriptoma da glândula de veneno de L. intermedia (GREMSKI et al., 2010) revelaram ESTs com similaridade a notinas previamente descritas como LiTx (De CASTRO et al., 2004). Sequências relacionadas à LiTx3 foram as mais abundantes no transcriptoma de L. intermedia, representando aproximadamente 13,9% de todas as ESTs obtidas e compreendendo 32% dos mRNAs codificantes de toxinas. Devido a alta proporção de sequências codificantes para peptídeos semelhantes a LiTx3, o presente estudo teve como objetivo a clonagem e expressão de um peptídeo dessa família. Primers foram desenhados para a realização das técnicas de 3' e 5' RACE, o qual teve como resultado a obtenção da sequência nucleotídica completa do cDNA correspondente ao peptídeo em estudo. A sequência do propeptídeo associado ao peptídeo maduro foi amplificada e modificada por PCR com primers contendo sítios de restrição para as enzimas XhoI e BamHI e inseridos no vetor de expressão pET-14b. A construção foi transformada em cepa de E. coli AD494(DE3). Um teste de expressão foi realizado para determinar as condições ótimas de expressão do peptídeo. Verificou-se que a indução com 0,5mM de IPTG, por 3 horas e meia, a 30oC era a melhor condição de expressão. A partir desse resultado, uma expressão em larga escala foi realizada, obtendo-se o peptídeo recombinante na fração solúvel, após cromatografia de afinidade em resina de Ni2+-NTA. A diversidade de peptídeos presentes no veneno de L. intermedia representa uma fonte importante de possíveis novas ferramentas moleculares com aplicação farmacológica e/ou biotecnológica.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:dspace.c3sl.ufpr.br:1884/29864 |
| Date | 06 August 2013 |
| Creators | Matsubara, Fernando Hitomi |
| Contributors | Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciencias Biológicas. Programa de Pós-Graduaçao em Biologia Celular e Molecular, Chaim, Olga Meiri, Veiga, Silvio Sanches |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPR, instname:Universidade Federal do Paraná, instacron:UFPR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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