Parasitoides criam condições favoráveis para seu desenvolvimento regulando processos fisiológicos do hospedeiro via a utilização de moléculas produzidas por tecidos maternos ou por tecidos derivados do parasitoide imaturo ou de simbiontes associados (vírus de poliDNA - PDV). Assim, essas moléculas se destacam como uma fonte preciosa para o desenvolvimento de métodos alternativos de controle de pragas. O objetivo desse trabalho foi o de explorar a interação hospedeiro-parasitoide, visando à identificação de moléculas que participem do processo de regulação hospedeira para o desenvolvimento de métodos alternativos de controle de pragas. A busca pela identificação dessas moléculas foi concentrada na interação Diatraea saccharalis (F.) (Lepidoptera: Crambidae) Cotesia flavipes (Cameron) (Hymenoptera: Braconidae) pela avaliação i) do efeito do parasitismo na fisiologia digestiva do hospedeiro e ii) da contribuição da glândula de veneno e do ovário na produção de moléculas bioativas e iii) pela caracterização de transcritos produzidos por teratócitos desse parasitoide. O potencial de aplicação de moléculas derivadas da interação hospedeiro-parasitoide foi verificado pela caracterização da atividade de uma quitinase putativa isolada da associação Heliothis virescens (F.) (Lepidoptera: Noctuidae) Toxoneuron nigriceps (Viereck) (Hymenoptera: Braconidae), via expressão heteróloga e transformação genética de plantas de fumo. Os resultados demonstraram que o parasitismo afeta a utilização do alimento por lagartas parasitadas, reduzindo as taxas de crescimento (RGR), consumo (RCR) e metabólica (RMR) relativas, enquanto aumenta a eficiência de conversão do digerido (ECD). O parasitismo por C. flavipes também aumentou a permanência do alimento no intestino do hospedeiro e a atividade de -amilase, sacarase e trealase em lagartas de D. saccharalis. Análises do transcriptoma da glândula de veneno e do ovário de C. flavipes indicaram a produção de muitas proteínas desconhecidas. Porém, foi possível identificar proteases, um inibidor de proteinase e uma proteína com ação antimicrobiana, produzidas pela glândula de veneno, e uma proteína de expressão precoce (ep1), como produto do ovário de C. flavipes. Dois transcritos isolados de teratócitos de C. flavipes foram putativamente identificados como serpina e fator de inibição da tradução (CfHTIF). Ambos os transcritos foram detectados em teratócitos após cinco dias do parasitismo, sendo que transcritos do CfHTIF também foram observados em hemócitos de hospedeiros parasitados. CfHTIF apresentou alta homologia a proteínas produzidas por PDVs associados a outras espécies de Cotesia, sugerindo a sua origem viral, sendo este o primeiro relato da utilização de teratócitos para a produção de proteínas virais voltadas à regulação hospedeira. A caracterização da atividade da quitinase de teratócitos de T. nigriceps e a avaliação do seu potencial biotecnológico via transgenia de plantas para o controle de lagartas de H. virescens indicou que, apesar dessa quitinase possuir capacidade de ligação à quitina coloidal e cristalina em ensaios in vitro, a mesma não demonstra qualquer atividade quitinolítica. Avaliações de plantas de fumo transformadas com o Tnchi não indicaram qualquer efeito deletério ao desenvolvimento de lagartas de H. virescens. Apesar da ausência de atividade quitinolítica, essa quitinase apresentou atividade antimicrobiana. A possibilidade de exploração dessa proteína na produção de plantas de interesse econômico é discutida. / Parasitoids regulate their hosts physiological processes in order to produce suitable conditions for their own development by employing molecules produced by maternal tissues, the immature parasitoid and derived tissues, and associated simbionts (polidnavirus PDV). These molecules represent, therefore, an untapped resource of new molecules for the development of alternative pest control methods. Our objective was to exploit the hostparasitoid interactions aiming at the identification of molecules involved in host regulation for their use in the development of alternative strategies for pest control. The search for new molecules was concentrated on the interaction Diatraea saccharalis (F.) (Lepidoptera: Crambidae) Cotesia flavipes (Cameron) (Hymenoptera: Braconidae) by assessing i) the effects of parasitization on the host digestive physiology and ii) the contribution of the venom gland and ovary in producing regulatory molecules, and by iii) the characterization of cDNAs isolated from teratocytes of C. flavipes. The potential application of molecules from hostparasitoid associations was verified by characterizing the activity of a putative chitinase isolated from the interaction Heliothis virescens (F.) (Lepidoptera: Noctuidae) Toxoneuron nigriceps (Viereck) (Hymenoptera: Braconidae) using recombinant proteins and geneticallymodified tobacco plants. Data obtained demonstrated parasitized larvae had reduced relative growth (RGR), consumption (RCR) and metabolic (RMR) rates, while an increased efficiency in the conversion of the digested food (ECD) was obtained as compared to unparasitized larvae. Larvae parasitized by C. flavipes retained the food in the gut for a longer period and had higher activities for -amylase, sacarase and trehalase if compared to control larvae. Analysis of the transcriptome of the venom gland and ovary of C. flavipes predicted a large number of unknown proteins. Nevertheless, several proteases, a protease inhibitor and an antimicrobial protein from the venom gland, and an early-expressed protein (ep1), with a putative role in the process of host regulation from the ovaries, were identified. Two cDNAs isolated from teratocytes of C. flavipes were putatively identified as a serpin and an eukaryote translation inhibitory factor (CfHTIF). Both were detected in teratocytes from day 5 of parasitism and onwards, with the CfHTIF being also detected in hemocytes of parasitized hosts. Comparative analysis of the CfHTIF indicated it is highly homologous to host translation inhibitory factors produced by PDVs associated with other species of Cotesia, indicating its possible viral origin and suggesting this to be the first record of teratocytes as a source of PDV-derived proteins for host regulation. The characterization of the activity from the chitinase isolated from teratocytes of T. nigreceps (Tnchi) and the evaluation of its biotechnological potential via plant transgenesis to control larvae of H. virescens indicated this chitinase can bind to colloidal and crystalline chitins in in vitro assays, but it does not display chitinolytic activity. Assays with transformed tobacco plants expressing Tnchi did not result in any effect to H. virescens larval development and survival. Although Tnchi did not have any chitinolytic activity, it did show to have an antimicrobial effect. The possible exploitation of this protein for production of economically-important plants is dicussed.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-30052012-085805 |
| Date | 23 April 2012 |
| Creators | Rossi, Guilherme Duarte |
| Contributors | Cônsoli, Fernando Luis |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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