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Previous issue date: 2016-08-29 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Vesículas de membrana externa (VMEs) liberadas principalmente por bactérias Gram negativas podem participar de diversos processos biológicos como sobrevivência bacteriana, aquisição de nutrientes, estabelecimento de biofilmes, comunicação celular e patogênese. Apesar da importância dessas vesículas em bactérias patogênicas, pouco ainda é conhecido sobre a formação e ocorrência de VMEs em bactérias de ecossistemas aquáticos. Este trabalho teve por objetivo investigar a ocorrência e formação de VMEs em bactérias cultiváveis de um ecossistema aquático amazônico. Para o estabelecimento de culturas bacterianas, amostras foram coletadas do Rio Negro (AM), submetidas à diluição seriada e semeadas em dois meios de cultura sólidos não seletivos: R2A e TSA. As colônias bacterianas em cultura foram caracterizadas em morfotipos de acordo com seus aspectos macroscópicos e microscópicos (forma, arranjo e composição da parede celular) por microscopia de luz. Os morfotipos foram transferidos para meio liquido (TSB) e a curva de crescimento estabelecida por densidade óptica através de espectrofotometria e densidade bacteriana pela microscopia de fluorescência. O estabelecimento das culturas de bactérias do Rio Negro apontaram que o meio R2A possibilitou o crescimento de mais morfotipos de colônias (10). Análises por microscopia de luz dos morfotipos mostraram uma maior ocorrência de bactérias Gram negativas (58,33%), com predominância de bacilos (51%) e distribuídas isoladamente (58,33%). A curva de densidade em meio líquido (TSB) mostrou-se estável na quarta hora de cultura, indicando o fim da fase exponencial e início da fase estacionária. A microscopia eletrônica de transmissão revelou bactérias de diferentes tamanhos (0,93 μm2 à 1.290 μm2) e envoltório celular com características típicas de espessura e composição dos grupos bacterianos gram-positivo e gramnegativo. Análises quantitativas demonstraram maior ocorrência de bactérias com parede celular tipicamente Gram negativa (77,28%), caracterizada pela presença de membrana plasmática, espaço periplasmático e membrana externa. Paralelamente, além das características morfológicas do envoltório celular bacteriano, foi possível a observação de estruturas bacterianas intra e extracelulares, como cápsula, flagelo, nucleóide, grânulos e septos de divisão e esporulação. A MET revelou a ocorrência de VMEs, brotando da membrana externa de bactérias Gram negativas em direção ao meio extracelular. A maior proporção de VMEs (83%) foi encontrada em processo de formação, aparecendo isoladamente ou formando grupamentos vesiculares aderidos ao envoltório celular. VMEs já completamente formadas, livres no meio extracelular também foram detectadas (17%) distantes ou próximas de grupos de bactérias. Análises morfométricas das VMEs revelaram vesículas de tamanhos variados (15 µm-300 µm de diâmetro). Porém, as vesículas aderidas às bactérias apresentaram menor diâmetro (60,94 ± 7,32 µm) em comparação com as vesículas livres no meio extracelular (149,4 ± 21,10 µm, p<0,0001). Em conjunto, o presente trabalho demonstrou a capacidade de bactérias aquáticas cultiváveis do Rio Negro secretarem VMEs durante o crescimento em cultura. O entendimento de diferentes aspectos morfológicos destas bactérias e a caracterização ultraestrutural das VMEs enfatiza o fato das bactérias de ecossistemas aquáticos constituírem microrganismos estruturalmente organizados, denotando sua complexidade funcional e adaptativa. / Outer membrane vesicles (OMVs) released by Gram negative bacteria play an important role in a variety of biological processes, such as bacterial survival, nutrient acquisition, biofilm establishment, cell communication and pathogenesis. Despite the importance of these vesicles in pathogenic bacteria, the formation and occurrence of OMVs in bacteria of aquatic ecosystems is still poorly understood. The present work aimed to investigate the occurrence and formation of OMVs in cultured bacteria from an Amazonian aquatic ecosystem. For bacterial cultures, samples were collected from Negro River (AM), serially diluted and spread-plate in two non-selective solid culture media: R2A and TSA. Colonies were characterized through macroscopic aspects and microscopic characteristics. Colonies morphotypes were transferred to non-selective liquid media (TSB) and the growth curve was analyzed by optical and cellular density, through spectrophotometry and fluorescence microscopy, respectively. Our results showed that R2A media enabled the growth of most colonies morphotypes (10). Microscopic analyses by light microscopy showed that Gram negative bacteria (58,33%), bacillus shape (51%) and isolate arrangement (58,33%) were predominant among bacterial morphotypes. The density curve showed a growth stabilization around the fourth hour of culture, indicating the end of the exponential phase and the begging of the stationary phase. Transmission electron microscopy revealed bacteria with different sizes (0,93 μm2 à 1.290 μm2) showing gram-positive and gram-negative envelopes. TEM quantitative analyses showed higher frequency of Gram negative bacteria (77,28%) exhibiting cell envelope composed by plasma membrane, periplasmic space and outer membrane. TEM enabled the visualization of intra and extracellular bacterial structures, such as capsule, flagellum, nucleiod, granules and cellular septa. TEM analyses revealed the occurrence of OMVs extruded from the outer membrane of Gram negative bacteria. The higher OMVs proportion was found in process of budding, appearing isolated or in clusters adhered to cellular envelope. Free OMVs were also detected in the extracellular medium, near or distant from bacterial clusters. Morphometric analyses showed vesicles with various sizes (15 µm-300 µm in diameter). However, vesicles in process of formation showed smaller size than free vesicles in the extracellular medium. Altogether, the present work demonstrated, for the first time, the ability of bacteria from Negro River to generate OMVs during growth in culture media. The ultrastructural characterization of OMVs emphasizes the fact that bacteria from aquatic ecosystems are structurally organized microorganisms denoting its functional and adaptive complexity.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:hermes.cpd.ufjf.br:ufjf/3703 |
| Date | 29 August 2016 |
| Creators | Andrade, Giselle Santos Cavalcanti Manhães de |
| Contributors | Melo, Rossana Correa Netto de, Noyma, Natália Pessoa, Amaral, Kátia Batista |
| Publisher | Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), Programa de Pós-graduação em Ecologia, UFJF, Brasil, ICB – Instituto de Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFJF, instname:Universidade Federal de Juiz de Fora, instacron:UFJF |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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