Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-03-17T12:02:10Z No. of bitstreams: 1 gisellesantoscavalcantimanhaesdeandrade.pdf: 2846359 bytes, checksum: 064267dc20f08e8554a167629e24dfae (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-03-18T11:50:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gisellesantoscavalcantimanhaesdeandrade.pdf: 2846359 bytes, checksum: 064267dc20f08e8554a167629e24dfae (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-18T11:50:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gisellesantoscavalcantimanhaesdeandrade.pdf: 2846359 bytes, checksum: 064267dc20f08e8554a167629e24dfae (MD5) Previous issue date: 2016-08-29 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Vesículas de membrana externa (VMEs) liberadas principalmente por bactérias Gram negativas podem participar de diversos processos biológicos como sobrevivência bacteriana, aquisição de nutrientes, estabelecimento de biofilmes, comunicação celular e patogênese. Apesar da importância dessas vesículas em bactérias patogênicas, pouco ainda é conhecido sobre a formação e ocorrência de VMEs em bactérias de ecossistemas aquáticos. Este trabalho teve por objetivo investigar a ocorrência e formação de VMEs em bactérias cultiváveis de um ecossistema aquático amazônico. Para o estabelecimento de culturas bacterianas, amostras foram coletadas do Rio Negro (AM), submetidas à diluição seriada e semeadas em dois meios de cultura sólidos não seletivos: R2A e TSA. As colônias bacterianas em cultura foram caracterizadas em morfotipos de acordo com seus aspectos macroscópicos e microscópicos (forma, arranjo e composição da parede celular) por microscopia de luz. Os morfotipos foram transferidos para meio liquido (TSB) e a curva de crescimento estabelecida por densidade óptica através de espectrofotometria e densidade bacteriana pela microscopia de fluorescência. O estabelecimento das culturas de bactérias do Rio Negro apontaram que o meio R2A possibilitou o crescimento de mais morfotipos de colônias (10). Análises por microscopia de luz dos morfotipos mostraram uma maior ocorrência de bactérias Gram negativas (58,33%), com predominância de bacilos (51%) e distribuídas isoladamente (58,33%). A curva de densidade em meio líquido (TSB) mostrou-se estável na quarta hora de cultura, indicando o fim da fase exponencial e início da fase estacionária. A microscopia eletrônica de transmissão revelou bactérias de diferentes tamanhos (0,93 μm2 à 1.290 μm2) e envoltório celular com características típicas de espessura e composição dos grupos bacterianos gram-positivo e gramnegativo. Análises quantitativas demonstraram maior ocorrência de bactérias com parede celular tipicamente Gram negativa (77,28%), caracterizada pela presença de membrana plasmática, espaço periplasmático e membrana externa. Paralelamente, além das características morfológicas do envoltório celular bacteriano, foi possível a observação de estruturas bacterianas intra e extracelulares, como cápsula, flagelo, nucleóide, grânulos e septos de divisão e esporulação. A MET revelou a ocorrência de VMEs, brotando da membrana externa de bactérias Gram negativas em direção ao meio extracelular. A maior proporção de VMEs (83%) foi encontrada em processo de formação, aparecendo isoladamente ou formando grupamentos vesiculares aderidos ao envoltório celular. VMEs já completamente formadas, livres no meio extracelular também foram detectadas (17%) distantes ou próximas de grupos de bactérias. Análises morfométricas das VMEs revelaram vesículas de tamanhos variados (15 µm-300 µm de diâmetro). Porém, as vesículas aderidas às bactérias apresentaram menor diâmetro (60,94 ± 7,32 µm) em comparação com as vesículas livres no meio extracelular (149,4 ± 21,10 µm, p<0,0001). Em conjunto, o presente trabalho demonstrou a capacidade de bactérias aquáticas cultiváveis do Rio Negro secretarem VMEs durante o crescimento em cultura. O entendimento de diferentes aspectos morfológicos destas bactérias e a caracterização ultraestrutural das VMEs enfatiza o fato das bactérias de ecossistemas aquáticos constituírem microrganismos estruturalmente organizados, denotando sua complexidade funcional e adaptativa. / Outer membrane vesicles (OMVs) released by Gram negative bacteria play an important role in a variety of biological processes, such as bacterial survival, nutrient acquisition, biofilm establishment, cell communication and pathogenesis. Despite the importance of these vesicles in pathogenic bacteria, the formation and occurrence of OMVs in bacteria of aquatic ecosystems is still poorly understood. The present work aimed to investigate the occurrence and formation of OMVs in cultured bacteria from an Amazonian aquatic ecosystem. For bacterial cultures, samples were collected from Negro River (AM), serially diluted and spread-plate in two non-selective solid culture media: R2A and TSA. Colonies were characterized through macroscopic aspects and microscopic characteristics. Colonies morphotypes were transferred to non-selective liquid media (TSB) and the growth curve was analyzed by optical and cellular density, through spectrophotometry and fluorescence microscopy, respectively. Our results showed that R2A media enabled the growth of most colonies morphotypes (10). Microscopic analyses by light microscopy showed that Gram negative bacteria (58,33%), bacillus shape (51%) and isolate arrangement (58,33%) were predominant among bacterial morphotypes. The density curve showed a growth stabilization around the fourth hour of culture, indicating the end of the exponential phase and the begging of the stationary phase. Transmission electron microscopy revealed bacteria with different sizes (0,93 μm2 à 1.290 μm2) showing gram-positive and gram-negative envelopes. TEM quantitative analyses showed higher frequency of Gram negative bacteria (77,28%) exhibiting cell envelope composed by plasma membrane, periplasmic space and outer membrane. TEM enabled the visualization of intra and extracellular bacterial structures, such as capsule, flagellum, nucleiod, granules and cellular septa. TEM analyses revealed the occurrence of OMVs extruded from the outer membrane of Gram negative bacteria. The higher OMVs proportion was found in process of budding, appearing isolated or in clusters adhered to cellular envelope. Free OMVs were also detected in the extracellular medium, near or distant from bacterial clusters. Morphometric analyses showed vesicles with various sizes (15 µm-300 µm in diameter). However, vesicles in process of formation showed smaller size than free vesicles in the extracellular medium. Altogether, the present work demonstrated, for the first time, the ability of bacteria from Negro River to generate OMVs during growth in culture media. The ultrastructural characterization of OMVs emphasizes the fact that bacteria from aquatic ecosystems are structurally organized microorganisms denoting its functional and adaptive complexity.

Vesículas de membrana externa, OMV, são formadas a partir de evaginações da membrana externa de bactérias Gram-negativas e têm ganhado interesse em suas funções biológicas por serem uma alternativa ao desenvolvimento de novas estratégias e combinações vacinais. OMV da bactéria comensal Neisseria lactamica induzem anticorpos que possuem reatividade cruzada com N. meningitidis e podem ser, além de antígeno para a doença meningocócica, um potencial adjuvante de mucosa. O objetivo deste trabalho é estabelecer condições de cultivo de N. lactamica para a obtenção de OMV e avaliar a função adjuvante destas OMV em combinação com o antígeno de superfície, PspA5, de Streptococcus pneumoniae. Foram realizados cultivos descontínuos em biorreatores de 5L por 10-15h. O meio de Catlin, MC, teve a concentração do substrato fonte de carbono (lactato) e aminoácidos modificada, além do acréscimo de extrato de levedura. Foram monitorados temperatura, pH, agitação e oxigênio dissolvido. Amostras foram coletadas a cada hora para análise de biomassa, consumo de nutrientes, produção de ácidos e concentração das OMV. Foram determinados os parâmetros cinéticos de produtividade máxima de células (ProdXmáx) e de produto (ProdPmáx), fatores de conversão (Yx/s, Yp/s e Yp/x) e velocidade de crescimento (Xmáx). O meio MC3LA2AA2YE (12h), com 18,0 g/L de lactato e o dobro da concentração original dos aminoácidos do MC foi o melhor, quando comparado aos demais para a obtenção de OMV. N. lactamica, cultivada nesta condição, apresentou produtividade máxima de OMV de 30,66 mg OMV/L.h, e concentração de OMV de 340,43 mg/L, na 11&#170; hora de cultivo. Os ensaios imunológicos foram realizados com a formulação de OMV puras ou OMV tratadas com detergente, para a retirada de parte do lipooligossacarídeo (LOS), em combinação com a proteína PspA5 de S. pneumoniae. O esquema de imunização foi de duas doses via intranasal, em modelo murino. Foram avaliados a indução de anticorpos IgG anti-PspA5 e o potencial protetor das formulações. Os grupos vacinais com adjuvante apresentaram indução de anticorpos IgG anti-PspA5 de aproximadamente 105ng/mL e sobrevivência de 100&#37;, 75&#37; e 66,7&#37;, respectivamente, para PspA5-OMVp, PspA5-OMVt0,5&#37;, e PspA5-OMVt0,3&#37; Os resultados evidenciam atividade adjuvante determinante das OMV em combinação com a proteína heteróloga PspA5 e proteção contra o desafio de Streptococcus pneumoniae em modelo murino. / Outer membrane vesicles, OMV, are formed and released from all Gram-negative bacteria´s outer membrane. Those vesicles have gained interest from scientific community due to their biological functions, as they can be a potential alternative to the development of new vaccine strategies and formulations. OMV from the commensal bacteria Neisseria lactamica induce antibodies that present cross reactivity with N. meningitidis and may be a potential mucosal adjuvant in addition to antigen for a meningococcal disease. The objective of this work is to define culture conditions of N. lactamica in order to obtain OMV, and evaluate the adjuvant function of their OMV in combination to the surface antigen, PspA5, from Streptococcus pneumoniae. Discontinuous batches cultures were carried out in 5L bioreactors for 10-15h. Catlin medium, MC, had its carbon substrate concentration (lactate) and its amino acids concentration modified according to each experiment, plus the addition of yeast extracts. Temperature, pH, agitation and dissolved oxygen were monitored. Samples were collected hourly for analysis of biomass, nutrient consumption, acid production and OMV yield. Maximal cell production products (ProdXmáx) and product (ProdPmáx), conversion factors (Yx/s, Yp/s e Yp/x) and growth rate (Xmáx) were obtained. The MC3LA2AA2YE medium (12h), with 18.0 g / L lactate and double the original MC amino acid concentrations, was the best formulation to obtain OMV. N. lactamica, cultivated in this condition, presented maximum OMV productivity of 30.66 mg OMV/L.h and OMV concentration of 340.43 mg/L, at the 11th hour of cultivation. Immunological assays were performed with formulations with native OMV or OMV treated with detergent to remove part of the lipooligosaccharide (LOS), in combination with S. pneumoniae PspA5 protein. Two-dose of intranasal immunization were administered in mice. An induction of anti-PspA5 IgG antibodies and the protective potential of the formulations were evaluated. Adjuvanted vaccine groups showed induction of anti-PspA5 IgG antibodies of approximately 105 ng/mL and 100&#37;, 75&#37; and 66.7&#37; survival, respectively for PspA5-OMVp, PspA5-OMVt0,5&#37;, e PspA5-OMVt0,3&#37;. The results obtained in this project show a significant adjuvant activity of Neisseria lactamica OMV in combination with heterologous protein PspA5 and protection against Streptococcus pneumoniae challenge in mice model.

Neisseria meningitidis é um diplococo Gramnegativo, aeróbio e encapsulado, causador mais comum de meningite e septicemia. Este agente é o principal causador de infecções bacterianas invasivas no mundo. Apesar de existirem 13 sorogrupos de N. meningitidis, apenas 6 são capazes de causar infecção: A, B, C, W135, X e Y. O sorogrupo B difere dos outros sorogrupos patogênicos por sua cápsula polissacáride ter composição idêntica ao ácido policiálico, presente em muitas glicoproteínas humanas, particularmente encontrados no tecido cerebral fetal, e bioquimicamente homóloga com a estrutura molecular de adesão do neurônio. Sendo assim, a cápsula polissacáride não pode ser usada em vacinas conjugadas, pois pode causar autoimunidade, sendo pouco imunogênica. Doenças meningocócicas causadas pelos sorogrupos A, C, Y e W135 podem ser prevenidas pelas vacinas que contêm polissacarídeos capsulares específicos conjugados. Para que uma vacina seja eficaz contra o sorogrupo B, é importante que esta abranja todos os sorotipos e seja capaz de promover imunidade duradoura, principalmente em crianças abaixo de dois anos, as mais acometidas. Vacinas baseadas em vesículas de membrana externa (OMVs, do inglês Outer Membrane Vesicles) de N. meningitidis B são amplamente estudadas. No presente estudo, OMVs de meningococo B (B:4:P1.9) foram associadas a um lipídio catiônico, o dioctadecildimetilamônio (DDA-BF) em preparação antigênica testada em camundongos fêmeas não isogênicos, e comparamos os títulos de anticorpos IgG, IgG1, IgG2a e IgG2b com os anticorpos produzidos por camundongos imunizados com a mesma OMVS associada ao hidróxido de alumínio, por ELISA. As análises foram realizadas com soros de cada animal colhidos individualmente, após 60 dias de imunização. A avidez dos anticorpos também foi analisada por ELISA. Immunoblot e Dot-ELISA avaliaram a reação específica entre a cepa homóloga usada na imunização e a reação a antígenos cruzados com outras cepas de meningococo. A hipersensibilidade tardia (HTT) foi comparada entre os dois grupos experimentais, após o desafio com cepa homóloga em uma das patas, depois de 24 horas da injeção, após 14 dias da primeira dose de imunização. / Neisseria meningitidis is an encapsulated Gram-negative aerobic diplococcus, the most commom meningitidis and sepsis agent , and the major bacterial invasive disease agent worldwide. Infections are caused by only 6 of 13 pathogenic serogroups: A,B,C, W135 and Y. Meningococcal serogroup B differs from the other pathogenic serogroups because it has a capsular polysaccharide identical to the polysialic acid present in many human glycoproteins, in particular, it is similar to carbohydrates found in fetal brain tissue. This is the reason that it does not allow the use of polysaccharide protein in conjugate vaccine, and for its low immunogenic. An effective meningococcal B vaccine development should cover all serotypes and be able to promote long term immunity, mainly in children under 2 years, the most affected age. Meningococcal outer membrane vesicles (OMVs) vaccines are widely studied. In this present study, meningococcal serogroup B OMVs (B:4:P1.9) was associated with a cationic lipid, dioctadecyldimetylammonium (DDA-BF) in an antigenic preparation tested in female outbred mice. Individual serum was collected, and antibodies titles IgG, IgG1, IgG2a were compared with animals immunized with OMVs and aluminium hydroxide, analyzed by ELISA. Analyses were carried out 60 days after first immunization. Antibodies avidity index were also analyzed by ELISA. Immunoblot and Dot-ELISA were carried out to evaluate specific reaction for homologous stranis and cross-reactive antigens present in other meningococcal strains. Delayed type hypersensitivity (DTH) was compared between two experimental groups, 24 hours before injection of homologous strain challenge.

Na primeira parte do estudo camundongos Swiss foram imunizados por diferentes vias de imunização com OMVs de Neissera meningitidis com DDA-BF ou HA como adjuvantes . Os adjuvantes e diferentes vias foram comparados quanto às respostas imunes por meio de ELISA ,Immunoblot ,HTT e análise histopatológica. Os animais imunizados apenas com adjuvantes não produziram títulos de anticorpos. Após única dose e decorridos 15 dias, a imunização com HA e antígeno apresentou títulos de IgG mais altos em relação ao DDA-BF nas vias subcutânea, intraperitoneal e intramuscular. Após 2 doses e 66 dias, todas as vias exibiram títulos de IgG, sendo as que receberam o HA com OMVs produziram títulos discretamente mais altos e ainda altos índices de avidez. O perfil da resposta imune quanto ao padrão Th1/Th2 foi avaliado. Ambos adjuvantes promoveram a produção de IgG2a, as respostas variaram de acordo com as vias de imunização utilizada. Enquanto as vias subcutânea e intramuscular induziram títulos semelhantes de IgG2a para ambos adjuvantes, a via intraperitoneal com DDA teve título mais alto. A produção de IgG1 foi modulada apenas por HA, sendo mais robusta na via subcutânea, seguida pela intramuscular com valores muito próximos aos da intraperitoneal. Camundongos isogênicos Balb/c H2d e C57Bl/6J H2b foram imunizados pela via subcutânea. Foram avaliadas as produções de anticorpos do tipo IgG, IgG1 e IgG2a, bem como o índice de avidez de IgG. De modo geral, os grupos de OMVs HA induziram maior produção de anticorpos que OMVs DDA ou apenas OMVs, enquanto os controles HA, DDA e salina não apresentaram níveis de anticorpos. Pelas técnicas utilizadas no estudo não observamos uma diferença significante entre os dois adjuvantes utilizados independente da via e da linhagem de camundongos utilizados. / In the first part of the study Swiss mice were immunized by different routes of immunization with OMVs of Neisseria meningitidis with DDA-BF or HA as adjuvants. Adjuvants and different routes were compared regarding immune responses through ELISA, Immunoblot, HTT and histopathological analysis. Animals immunized with only adjuvants did not produce evidence of antibodies. After single dose and 15 days, of immunization with HA presented antigen specific IgG higher in relation to the DDa-BF in the subcutaneous, intraperitoneal and intramuscular immunization . After 2 doses and 66 days, all exhibited IgG, and the bonds that received the HA with OMVs produced titles discreetly higher and still high levels of antibodies. The profile of the immune response to Th1/Th2 pattern has been evaluated. Both adjuvants promoted the production of IgG2a, the responses varied according to the immunization routes used. While the subcutaneous and intramuscular routes induced similar titles of IgG2a to both adjuvant intraperitoneal route with had highest title. IgG1 production was modulated only by HA, being more robust in subcutaneous injection, followed by intramuscular with values very close to those of intraperitoneal. Isogenic Balb/c and C57Bl/6J H2d H2b mice were immunized by subcutaneous administration. Been evaluated antibody production of type IgG, IgG1 and IgG2a, as well as the IgG avidity index. In General, the greater production of OMVs HA induced antibodies that OMVs DDA or just OMVs, while the controls .DDA-BF and controls showed no antibody levels. The techniques used in the study did not observe a significant difference between the two adjuvants used independent of the route and of mice strains used.

Neisseria meningitidis é um diplococo Gramnegativo, aeróbio e encapsulado, causador mais comum de meningite e septicemia. Este agente é o principal causador de infecções bacterianas invasivas no mundo. Apesar de existirem 13 sorogrupos de N. meningitidis, apenas 6 são capazes de causar infecção: A, B, C, W135, X e Y. O sorogrupo B difere dos outros sorogrupos patogênicos por sua cápsula polissacáride ter composição idêntica ao ácido policiálico, presente em muitas glicoproteínas humanas, particularmente encontrados no tecido cerebral fetal, e bioquimicamente homóloga com a estrutura molecular de adesão do neurônio. Sendo assim, a cápsula polissacáride não pode ser usada em vacinas conjugadas, pois pode causar autoimunidade, sendo pouco imunogênica. Doenças meningocócicas causadas pelos sorogrupos A, C, Y e W135 podem ser prevenidas pelas vacinas que contêm polissacarídeos capsulares específicos conjugados. Para que uma vacina seja eficaz contra o sorogrupo B, é importante que esta abranja todos os sorotipos e seja capaz de promover imunidade duradoura, principalmente em crianças abaixo de dois anos, as mais acometidas. Vacinas baseadas em vesículas de membrana externa (OMVs, do inglês Outer Membrane Vesicles) de N. meningitidis B são amplamente estudadas. No presente estudo, OMVs de meningococo B (B:4:P1.9) foram associadas a um lipídio catiônico, o dioctadecildimetilamônio (DDA-BF) em preparação antigênica testada em camundongos fêmeas não isogênicos, e comparamos os títulos de anticorpos IgG, IgG1, IgG2a e IgG2b com os anticorpos produzidos por camundongos imunizados com a mesma OMVS associada ao hidróxido de alumínio, por ELISA. As análises foram realizadas com soros de cada animal colhidos individualmente, após 60 dias de imunização. A avidez dos anticorpos também foi analisada por ELISA. Immunoblot e Dot-ELISA avaliaram a reação específica entre a cepa homóloga usada na imunização e a reação a antígenos cruzados com outras cepas de meningococo. A hipersensibilidade tardia (HTT) foi comparada entre os dois grupos experimentais, após o desafio com cepa homóloga em uma das patas, depois de 24 horas da injeção, após 14 dias da primeira dose de imunização. / Neisseria meningitidis is an encapsulated Gram-negative aerobic diplococcus, the most commom meningitidis and sepsis agent , and the major bacterial invasive disease agent worldwide. Infections are caused by only 6 of 13 pathogenic serogroups: A,B,C, W135 and Y. Meningococcal serogroup B differs from the other pathogenic serogroups because it has a capsular polysaccharide identical to the polysialic acid present in many human glycoproteins, in particular, it is similar to carbohydrates found in fetal brain tissue. This is the reason that it does not allow the use of polysaccharide protein in conjugate vaccine, and for its low immunogenic. An effective meningococcal B vaccine development should cover all serotypes and be able to promote long term immunity, mainly in children under 2 years, the most affected age. Meningococcal outer membrane vesicles (OMVs) vaccines are widely studied. In this present study, meningococcal serogroup B OMVs (B:4:P1.9) was associated with a cationic lipid, dioctadecyldimetylammonium (DDA-BF) in an antigenic preparation tested in female outbred mice. Individual serum was collected, and antibodies titles IgG, IgG1, IgG2a were compared with animals immunized with OMVs and aluminium hydroxide, analyzed by ELISA. Analyses were carried out 60 days after first immunization. Antibodies avidity index were also analyzed by ELISA. Immunoblot and Dot-ELISA were carried out to evaluate specific reaction for homologous stranis and cross-reactive antigens present in other meningococcal strains. Delayed type hypersensitivity (DTH) was compared between two experimental groups, 24 hours before injection of homologous strain challenge.

Esta memoria doctoral forma parte del proyecto financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación (CICYT, CTQ2010-21183-C02-01), el cual tiene entre sus objetivos la búsqueda de nuevas cepas con capacidad para producir emulsionantes naturales poliméricos. Existe un interés real en el aislamiento y caracterización estructural y funcional de nuevos exopolímeros (EPS) obtenidos a partir de microorganismos de ambientes extremos que pudieran ser utilizados con estos fines en diversas industrias. Para ello, se realizó en primer lugar el estudio de los EPS desde el punto de vista ultraestructural, de cepas antárticas adaptadas al frío, mediante técnicas de microscopía electrónica de transmisión (MET) después de procesar las muestras por criofijación a alta presión seguida de criosustitución (HPF-FS). Estas técnicas aportaron numerosos detalles sobre la ultraestructura de las distintas cepas y el material extracelular que producen, al lograr preservar el material biológico próximo a su estado natural. Se observó que este material polimérico extracelular es para la mayoría de las cepas complejo con la presencia de material capsular alrededor de las células y abundantes estructuras vesiculares dispersas en la matriz extracelular secretada por las bacterias. Es la primera vez que se describen y visualizan de manera tan clara y abundante las vesículas de membrana externa (VME) que producen bacterias no patógenas de ambientes naturales antárticos. De igual forma, es la primera vez que se reporta la presencia de estas estructuras en cepas de los géneros Marinobacter y Psychrobacter. Asimismo, se estudió el origen de las proteínas presentes en las VME mediante geles SDS-PAGE donde se mostraron los perfiles proteicos comparados con las proteínas de membrana externa. Esto evidenció el origen de estas VME formadas a partir de esta membrana, al presentar proteínas en la fracción de VME, que comigraron con proteínas que estaban presentes en la fracción de membrana externa, además en el perfil proteico de la membrana externa se detectaron proteínas adicionales que no estaban presentes en VME. Se estudió la influencia de la temperatura sobre la producción y morfología de VME producidas en la cepa S. livingstonensis NF22T Para esta bacteria psicrotolerante se demostró que la temperatura influye en la producción de VME. A bajas temperaturas la cantidad de VME que produce la cepa es mayor, su tamaño es menor y más regular y el perfil electroforético muestra la expresión diferencial de algunas proteínas, viéndose sobrexpresadas proteínas relacionadas con funciones de transporte a nivel de membrana. Se realizaron análisis proteómicos para identificar las proteínas presentes en las VME producidas a 4 y 16 ºC a partir de S. livingstonensis NF22T y S. vesiculosa M7T. Para ambas cepas se identificaron fundamentalmente proteínas de membrana externa y periplasmáticas con diferentes funciones fisiológicas, destacando por su abundancia las proteínas implicadas en el transporte y metabolismo de iones inorgánicos así como las relacionadas en la biogénesis de las envueltas celulares. El material extracelular (EPS) obtenido y purificado a partir de Shewanella vesiculosa M7T presentó mayor actividad emulsionante frente a aceites comestibles que los emulsionantes comercializados goma arábiga y xantano y su caracterización reveló que contiene abundantes VME y polímeros polisacarídicos, siendo sus componentes químicos mayoritarios azúcares neutros y aminados, lípidos de membrana y aminoácidos. / The present work is part of the research project (CICYT, CTQ2010-21183-C02-01), which has among its objectives the search for new strains capable to produce natural polymeric emulsifiers. There is a real interest in the isolation and structural and functional characterization of new exopolymers (EPS) derived from microorganisms of extreme environments that could be used for these purposes in various industries. Many Gram-negative, cold-adapted bacteria from the Antarctic environment produce large amounts of extracellular matter, which has potential biotechnology applications. We examined the ultrastructure of extracellular matter from Antarctic bacteria by transmission electronic microscopy after high pressure freezing and freeze substitution. All analyzed extracellular matter appeared as a netlike mesh composed of a capsular polymer around cells and large numbers of outer membrane vesicles (OMV), which have not been described for members of the genera Psychrobacter and Marinobacter so far. OMV showed the typical characteristics described for these structures, and seemed to be surrounded by the same capsular polymer as that found around cells. The analysis of OMV proteins from Antarctic strains by SDS-PAGE showed different banding profiles in OMV compared to the outer membrane, suggesting some kind of protein sorting during membrane vesicle formation. For the psychrotolerant bacterium, S. livingstonensis NF22T, the growth temperature seemed to influence the amount and morphology of OMV. In an initial attempt to elucidate the functions of OMV from S. livingstonensis NF22T and S. vesiculosa M7T we conducted a proteomic analysis on membrane vesicles obtained at 4 and 16°C. At both temperatures, OMV were highly enriched in outer membrane proteins and periplasmic proteins related to nutrient processing and transport in Gram-negative bacteria, suggesting that OMV could be related with nutrient sensing and bacterial survival. Differences were observed in the expression of some proteins depending on incubation temperature but further studies will be necessary to define their roles and implications in the survival of bacteria in the extreme Antarctic environment. The extracellular material (EPS) obtained and purified from Shewanella vesiculosa M7T had a higher emulsifying activity against edible oils than commercial emulsifiers like arabic and xanthan gums. Characterization of this EPS revealed that it contains abundant OMV and polysaccharides polymers, with neutral and amino sugars, membrane lipids and aminoacids as its major chemical components.