Doctorado en Ciencias mención Microbiología. / Acidithiobacillus thiooxidans es una bacteria que obtiene energía metabólica y poder reductor a partir de la oxidación de compuestos reducidos de azufre. En estado natural, esta bacteria se encuentra junto con otros microorganismos participantes del consorcio de biolixiviación de sulfuros metálicos formando estructuras multicelulares llamadas biopelículas sobre la superficie de sulfuros minerales. Las células están embebidas en una matriz de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) las cuales se componen principalmente de exopolisacáridos, proteínas y lípidos. Se ha descrito que la solubilización de los minerales sulfurados metálicos está mediada por estos EPS. Sin embargo, la composición de los EPS y su rol exacto en la solubilización de sulfuros metálicos ha sido caracterizado solamente en la bacteria oxidadora de hierro y azufre Acidithiobacillus ferrooxidans, aunque las demás especies de Acidithiobacillus que son capaces de oxidar solamente compuestos reducidos del azufre son fundamentales en estos procesos de lixiviación. En base a estos antecedentes, nos propusimos caracterizar alguno de los EPS y los mecanismos moleculares involucrados en la formación de biopelículas en la especie modelo At. thiooxidans. En un trabajo previo, se identificó un gen putativo que codifica para una proteína de unión a c-di-GMP PelD, la cual está caracterizada en Pseudomonas aeruginosa formando parte de un complejo multiproteico de membrana involucrado en vii la biosíntesis del exopolisacárido Pel. Al analizar el contexto genético del gen pelD, se identificó un putativo operón con una estructura similar al operón canónico identificado en P. aeruginosa. El análisis comparativo entre los genomas disponibles de las bacterias acidófilas que están presentes en los entornos minerales ácidos reveló que este operón sólo está presente en los genomas de At. thiooxidans y At. caldus. Ante este resultado, este trabajo se enfocó en comprender cuál sería la importancia de este exopolisacárido en la formación de biopelículas de At. thiooxidans sobre la superficie de azufre elemental. La medición de los niveles de transcrito mediante qPCR mostró que los genes pelA, pelD y wcaG del putativo operón presentan un mayor de expresión en células adheridas que en células planctónicas. El análisis de azúcares de superficie mediante el uso de lectinas identificó la presencia de N-acetil-galactosamina y N-acetil-glucosamina. Tratando de dilucidar algunas de las señales que regulan la producción de Pel, se descubrió que la adición exógena de la molécula de Quorum Sensing (QS) 3-oxo-C8 AHL incrementa la transcripción de los genes pelA y pelD. Finalmente, se procedió a obtener una cepa mutante nula en el gen pelD mediante recombinación homóloga. Luego de analizar el DNA de esta cepa, se realizaron análisis de adherencia y formación de biopelículas sobre la superficie de azufre elemental mediante microscopía electrónica y de epifluorescencia. La mutación ΔpelD afectó la estructura de la biopelícula al reducir la presencia de N-acetil-galactosamina y N-acetilglucosamina en la superficie, pero adicionalmente provocó un incremento en la viii producción de estructuras filamentosas que rodean a las células. Para resolver la incógnita sobre la naturaleza de estas fibras, se realizaron análisis comparativos preliminares de la expresión de proteínas extracelulares. El análisis del sobrenadante de los cultivos y de las proteínas del EPS reveló un cambio en producción de proteínas secretadas al medio. En base a estos resultados es posible concluir que el exopolisacárido Pel producido por la bacteria biominera At. thiooxidans juega un rol estructural en la formación de biopelículas sobre la superficie de azufre elemental y que la regulación de su síntesis involucra a las vías del QS y del c-di-GMP. / Acidithiobacillus thiooxidans is a bacterium that obtains metabolic energy and reducing power from the oxidation of reduced sulfur compounds. In the natural state, this bacterium is found along with other microorganisms that are members of the metal sulfides bioleaching consortium forming multicellular structures called biofilms on the surface of mineral sulfides. The cells are embedded in a matrix of extracellular polymeric substances (EPS) which are composed mainly of exopolysaccharides, proteins and lipids. It has been described that the solubilization of the metal sulfide minerals is mediated by these EPS. However, the composition of the EPS and their exact role in the solubilization of metal sulfides has been characterized only in the iron and sulfur oxidizer bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans, although the other Acidithiobacillus species that are only capable of oxidizing reduced sulfur compounds are important in these leaching processes. Based on this background, we set out to characterize some of the EPS and the molecular mechanisms involved in biofilm formation in the model species At. thiooxidans. In a previous work it was identified a putative gene encoding a c-di-GMP binding PelD protein, which is characterized as part of a multiprotein membrane complex involved in Pel exopolysaccharide biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. x When we were analyzing the genetic context of the pelD gene, a putative operon with a structure similar to the canonical operon identified in P. aeruginosa was identified. Comparative analysis between available genomes of acidophilic bacteria that are present in acidic mineral environments revealed that this operon is only present in the genomes of At. thiooxidans and At. caldus. Given this result, this work focused on understanding the importance of this exopolisaccharide in biofilm formation of At. thiooxidans on the surface of elemental sulfur. Measurement of transcript levels by qPCR showed that pelA, pelD and wcaG genes of the putative operon exhibit a greater expression in attached cells than in planktonic cells. The analysis of surface sugars by the use of lectins identified the presence of N-acetyl-galactosamine and N-acetyl-glucosamine. Trying to elucidate some of the signals that regulates the production of Pel, it was discovered that the exogenous addition of Quorum Sensing (QS) molecule of 3-oxo-C8 AHL increases the transcription of pelA and pelD genes. Finally, a pelD gene null mutant strain was obtained by homologous recombination. After analyzing the DNA of this strain, adherence and biofilm formation analysis were performed on the elemental sulfur surface by electronic and epifluorescence microscopy. The ΔpelD mutation affected the structure of the biofilm by reducing the presence of N-acetyl-galactosamine and N-acetyl glucosamine on the surface, but additionally caused an increase in the production of fibrillar structures xi surrounding the cells. To solve the unknown about the nature of these fibers, preliminary comparative analysis of extracelluar protein expression were performed. Analysis of the culture supernatant and proteins from EPS revealed a change in production of secreted proteins to the medium. Based on these results it is possible to conclude that the Pel exopolisaccharide produced by the biomining bacterium At. thiooxidans plays a structural role at biofilm formation on the surface of elemental sulfur and that the regulation of its synthesis involves QS and c-di-GMP pathways. / Proyectos regulares Fondecyt 1120295 y 1160702 y beca Conicyt 21120064 por aportar el financiamiento durante el desarrollo de la tesis.

In this Doctoral Thesis the study of the influence of the operating parameters of the activated sludge process on the physical and chemical characteristics of the mixed liquor, from different membrane bioreactors (MBR), has been carried out. In addition, an optical characterization of the mixing liquor has been performed. In order to achieve the above mentioned aim, samples of the mixed liquor from an MBR treating municipal wastewater were first analysed and then, the characteristics of two MBR mixed liquors treating the leachates from two treatment plants of the organic fraction of municipal solid waste (OFMSW) were evaluated. It is noteworthy that the difference between the two industrial MBR lies on the feeding (inlet) to the MBR, which is determined by the treatment performed to the OFMSW, since one of them consists of a wet anaerobic digestion (MBR-LS) and the other of a dry anaerobic digestion (MBR-HS), so that the latter leachate contains higher concentration of suspended solids in its composition. For the chemical characterization of the mixture liquor, the extracellular polymeric substances (EPS) have been analysed. EPS are formed by the sum of extracted extracellular polymeric substances (eEPS) and soluble microbial products (SMP). These substances are considered the main cause of membranes fouling in MBRs and are basically formed by proteins and polysaccharides, which can be both attached to the cell wall and outside the cell, in form of eEPS or SMP. Regarding the physical characterization, in particular it has been analysed and studied the effect on the membrane fouling of the total and volatile suspended solids, the viscosity, the capillary suction time and the particle size, measured through the resistance to filtration. Finally, in the municipal MBR, cell viability with epifluorescence microscopy has been studied, as well as the main components of EPS have been stained by two different methods. In addition, a statistical study has evaluated the effect of the main operating parameters of the MBR on the characterization parameters of the mixed liquor. By means of least squares regression, the operational parameters that influence SMP production in industrial MBR have been studied. The study was completed by evaluating the fouling of an ultrafiltration membrane with proteins extracted from EPS and subsequently purified with ammonium sulphate at different pH values. To this end, different synthetic proteins (bovine serum albumin, casein, haemoglobin and lysozyme) were first analysed and then compared with the proteins extracted from the mixed liquor. Membrane fouling with purified eEPS proteins has also been studied along with sodium alginate added in the same concentration as the proteins. The results obtained demonstrate, firstly, that SMP play an important role in the membrane fouling. The concentration of proteins has been considerably higher than that of carbohydrates both in SMP and in eEPS, although SMP influenced to a greater extent on the filtration of the activated sludge. In addition, it is shown that bacteria under stress conditions, caused for example by increase in conductivity, increase the production of SMP, and therefore, membrane fouling increases. On the other hand, it is concluded that a low hydraulic retention time favours a high carbohydrates concentration and consequently drives to an increase in the viscosity and capillary suction time, also increasing the membrane fouling. / En la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo el estudio de la influencia de los parámetros de operación del proceso de fangos activos en las características físicas y químicas de los licores de mezcla, procedentes de diferentes biorreactores de membrana (MBR). Además, se ha realizado una caracterización óptica del licor de mezcla. Para ello, en primer lugar se tomaron muestras del licor de mezcla de un MBR que trata aguas residuales urbanas y, a continuación, se evaluaron las características de los licores de mezcla de dos MBR que tratan los lixiviados procedentes de dos plantas de tratamiento de la fracción orgánica de los residuos sólidos urbanos (FORSU). Cabe destacar que la diferencia entre los dos MBR industriales radica en la alimentación (afluentes) al MBR, que viene determinada por el tratamiento que se realiza a la FORSU, ya que uno de ellos consiste en una digestión anaerobia en vía húmeda (MBR-LS) y, el otro, en una digestión anaerobia en vía seca (MBR-HS), por lo que este último lixiviado contiene mayor concentración de sólidos en suspensión en su composición. Para la caracterización química del licor de mezcla, se han analizado las sustancias poliméricas extracelulares (EPS), formadas por la suma de las sustancias poliméricas extracelulares extraídas (eEPS) y los productos solubles microbianos (SMP). Estas sustancias se consideran las principales causantes del ensuciamiento de las membranas del MBR y están formadas básicamente por proteínas y polisacáridos, los cuales pueden estar tanto adheridos a la pared celular como fuera de la célula, en forma de eEPS o SMP. En cuanto a la caracterización física, en concreto se ha analizado y estudiado el efecto en el ensuciamiento de las membranas de los sólidos en suspensión totales y volátiles, la viscosidad, el tiempo de succión capilar y el tamaño de partícula, medido a través de las resistencias a la filtración. Finalmente, en el MBR urbano se ha estudiado la viabilidad celular con microscopía de epifluorescencia, así como se han teñido para su caracterización óptica los principales componentes de las EPS por dos métodos distintos. Además, mediante un estudio estadístico se ha evaluado el efecto de los principales parámetros de operación de los MBR sobre los parámetros de caracterización del licor de mezcla. Mediante regresión por mínimos cuadrados se han estudiado los parámetros operacionales que influyen en la producción de SMP en los MBR industriales. El estudio se ha completado evaluando el ensuciamiento de una membrana de ultrafiltración con proteínas extraídas de las EPS y posteriormente purificadas con sulfato amónico, a diferentes valores de pH. Para ello, en primer lugar se han caracterizado diferentes proteínas sintéticas (albúmina de suero bovino, caseína, hemoglobina y lisozima) para compararlas con las proteínas extraídas del licor de mezcla. También se ha estudiado el ensuciamiento de la membrana con las proteínas purificadas de las eEPS junto con alginato de sodio en la misma proporción. Los resultados obtenidos demuestran en primer lugar que los SMP juegan un papel importante en el ensuciamiento de las membranas. Tanto en su composición como en la de las eEPS, la concentración de proteínas determinada ha sido considerablemente mayor que la de carbohidratos, si bien éstos influyen incluso en mayor medida en la filtrabilidad del fango activo. Además, se demuestra que las bacterias bajo condiciones de estrés, causado por ejemplo por aumento de conductividad, aumentan la producción de SMP, y por tanto, se incrementa el ensuciamiento de las membranas. Por otro lado, se concluye que un tiempo de retención hidráulico bajo favorece una concentración elevada de carbohidratos y consecuentemente provoca un aumento de la viscosidad y el tiempo de succión capilar, aumentando también el ensuciamiento de la membrana. / En la present Tesi Doctoral s'ha dut a terme l'estudi de la influència dels paràmetres d'operació del procés de fangs actius en les característiques físiques i químiques de licors de mescla, procedents de diferents biorreactors de membrana (MBR). A més, s'ha realitzat una caracterització òptica del licor de mescla. Per a això, en primer lloc es van prendre mostres del licor de mescla d'un MBR que tracta aigües residuals urbanes i, a continuació, es van avaluar les característiques dels licors de mescla de dos MBR que tracten els lixiviats procedents de dues plantes de tractament de la fracció orgànica dels residus sòlids urbans (FORSU). Cal destacar que la diferència entre els dos MBR industrials radica en l'alimentació (afluents) al MBR, que ve determinada pel tractament que es realitza a la FORSU, ja que un d'ells consisteix en una digestió anaeròbia en via humida (MBR-LS) i, l'altre, en una digestió anaeròbia en via seca (MBR-HS), per la qual cosa este últim lixiviat conté major concentració de sòlids en suspensió en la seua composició. Per a la caracterització química del licor de mescla, s'han analitzat les substàncies polimèriques extracel¿lulars (EPS), formades per la suma de les substàncies polimèriques extracel¿lulars extretes (eEPS) i els productes solubles microbians (SMP). Estes substàncies es consideren les principals causants de l'embrutiment de les membranes del MBR i estan formades bàsicament per proteïnes i polisacàrids, els quals poden estar tant adherits a la paret cel¿lular com fora de la cèl¿lula, en forma d'eEPS o SMP. Quant a la caracterització física, en concret s'ha analitzat i estudiat l'efecte en l'embrutiment de les membranes dels sòlids en suspensió totals i volàtils, la viscositat, el temps de succió capil¿lar i la grandària de partícula, mesurat a través de les resistències a la filtració. Finalment, en el MBR urbà s'ha estudiat la viabilitat cel¿lular amb microscòpia d'epifluorescència, així com s'han tenyit per a la seua caracterització òptica els principals components de les EPS per dos mètodes distints. A més, per mitjà d'un estudi estadístic s'ha avaluat l'efecte dels principals paràmetres d'operació dels MBR sobre els paràmetres de caracterització del licor de mescla. Per mitjà de regressió per mínims quadrats s'han estudiat els paràmetres operacionals que influeixen en la producció de SMP en els MBR industrials. L'estudi s'ha completat avaluant l'embrutiment d'una membrana d'ultrafiltració amb proteïnes extretes de les EPS i posteriorment purificades amb sulfat amònic, a diferents valors de pH. Per a això, en primer lloc s'han caracteritzat diferents proteïnes sintètiques (albúmina de sèrum boví, caseïna, hemoglobina i lisozima) per a comparar-les amb les proteïnes extretes del licor de mescla. També s'ha estudiat l'embrutiment de la membrana amb les proteïnes purificades de les eEPS junt amb alginat de sodi en la mateixa proporció. Els resultats obtinguts demostren en primer lloc que els SMP juguen un paper important en l'embrutiment de les membranes. Tant en la seua composició com en la de les eEPS, la concentració de proteïnes determinada ha sigut considerablement major que la de carbohidrats, si bé estos influeixen inclús en major grau en la filtrabilidad del fang actiu. A més, es demostra que els bacteris baix condicions d'estrès, causat per exemple per augment de conductivitat, augmenten la producció de SMP, i per tant, s'incrementa l'embrutiment de les membranes. D'altra banda, es conclou que un temps de retenció hidràulic baix afavoreix una concentració elevada de carbohidrats i conseqüentment provoca un augment de la viscositat i el temps de succió capil¿lar, augmentant també l'embrutiment de la membrana. / Zuriaga Agustí, E. (2017). Influencia de las características físicas y químicas del licor de mezcla en Bioreactores de Membrana y su correlación con los parámetros de operación en aguas residuales urbanas e industriales [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90512 / TESIS

Esta memoria doctoral forma parte del proyecto financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación (CICYT, CTQ2010-21183-C02-01), el cual tiene entre sus objetivos la búsqueda de nuevas cepas con capacidad para producir emulsionantes naturales poliméricos. Existe un interés real en el aislamiento y caracterización estructural y funcional de nuevos exopolímeros (EPS) obtenidos a partir de microorganismos de ambientes extremos que pudieran ser utilizados con estos fines en diversas industrias. Para ello, se realizó en primer lugar el estudio de los EPS desde el punto de vista ultraestructural, de cepas antárticas adaptadas al frío, mediante técnicas de microscopía electrónica de transmisión (MET) después de procesar las muestras por criofijación a alta presión seguida de criosustitución (HPF-FS). Estas técnicas aportaron numerosos detalles sobre la ultraestructura de las distintas cepas y el material extracelular que producen, al lograr preservar el material biológico próximo a su estado natural. Se observó que este material polimérico extracelular es para la mayoría de las cepas complejo con la presencia de material capsular alrededor de las células y abundantes estructuras vesiculares dispersas en la matriz extracelular secretada por las bacterias. Es la primera vez que se describen y visualizan de manera tan clara y abundante las vesículas de membrana externa (VME) que producen bacterias no patógenas de ambientes naturales antárticos. De igual forma, es la primera vez que se reporta la presencia de estas estructuras en cepas de los géneros Marinobacter y Psychrobacter. Asimismo, se estudió el origen de las proteínas presentes en las VME mediante geles SDS-PAGE donde se mostraron los perfiles proteicos comparados con las proteínas de membrana externa. Esto evidenció el origen de estas VME formadas a partir de esta membrana, al presentar proteínas en la fracción de VME, que comigraron con proteínas que estaban presentes en la fracción de membrana externa, además en el perfil proteico de la membrana externa se detectaron proteínas adicionales que no estaban presentes en VME. Se estudió la influencia de la temperatura sobre la producción y morfología de VME producidas en la cepa S. livingstonensis NF22T Para esta bacteria psicrotolerante se demostró que la temperatura influye en la producción de VME. A bajas temperaturas la cantidad de VME que produce la cepa es mayor, su tamaño es menor y más regular y el perfil electroforético muestra la expresión diferencial de algunas proteínas, viéndose sobrexpresadas proteínas relacionadas con funciones de transporte a nivel de membrana. Se realizaron análisis proteómicos para identificar las proteínas presentes en las VME producidas a 4 y 16 ºC a partir de S. livingstonensis NF22T y S. vesiculosa M7T. Para ambas cepas se identificaron fundamentalmente proteínas de membrana externa y periplasmáticas con diferentes funciones fisiológicas, destacando por su abundancia las proteínas implicadas en el transporte y metabolismo de iones inorgánicos así como las relacionadas en la biogénesis de las envueltas celulares. El material extracelular (EPS) obtenido y purificado a partir de Shewanella vesiculosa M7T presentó mayor actividad emulsionante frente a aceites comestibles que los emulsionantes comercializados goma arábiga y xantano y su caracterización reveló que contiene abundantes VME y polímeros polisacarídicos, siendo sus componentes químicos mayoritarios azúcares neutros y aminados, lípidos de membrana y aminoácidos. / The present work is part of the research project (CICYT, CTQ2010-21183-C02-01), which has among its objectives the search for new strains capable to produce natural polymeric emulsifiers. There is a real interest in the isolation and structural and functional characterization of new exopolymers (EPS) derived from microorganisms of extreme environments that could be used for these purposes in various industries. Many Gram-negative, cold-adapted bacteria from the Antarctic environment produce large amounts of extracellular matter, which has potential biotechnology applications. We examined the ultrastructure of extracellular matter from Antarctic bacteria by transmission electronic microscopy after high pressure freezing and freeze substitution. All analyzed extracellular matter appeared as a netlike mesh composed of a capsular polymer around cells and large numbers of outer membrane vesicles (OMV), which have not been described for members of the genera Psychrobacter and Marinobacter so far. OMV showed the typical characteristics described for these structures, and seemed to be surrounded by the same capsular polymer as that found around cells. The analysis of OMV proteins from Antarctic strains by SDS-PAGE showed different banding profiles in OMV compared to the outer membrane, suggesting some kind of protein sorting during membrane vesicle formation. For the psychrotolerant bacterium, S. livingstonensis NF22T, the growth temperature seemed to influence the amount and morphology of OMV. In an initial attempt to elucidate the functions of OMV from S. livingstonensis NF22T and S. vesiculosa M7T we conducted a proteomic analysis on membrane vesicles obtained at 4 and 16°C. At both temperatures, OMV were highly enriched in outer membrane proteins and periplasmic proteins related to nutrient processing and transport in Gram-negative bacteria, suggesting that OMV could be related with nutrient sensing and bacterial survival. Differences were observed in the expression of some proteins depending on incubation temperature but further studies will be necessary to define their roles and implications in the survival of bacteria in the extreme Antarctic environment. The extracellular material (EPS) obtained and purified from Shewanella vesiculosa M7T had a higher emulsifying activity against edible oils than commercial emulsifiers like arabic and xanthan gums. Characterization of this EPS revealed that it contains abundant OMV and polysaccharides polymers, with neutral and amino sugars, membrane lipids and aminoacids as its major chemical components.