Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / Acidithiobacillus ferrooxidans es una bacteria quimiolitoautótrofa, acidófila, involucrada en un consorcio bacteriano capaz de biolixiviar metales como el cobre. Este microorganismo posee la capacidad de vivir en ambientes con altas concentraciones de metales. Por ello que esta bacteria es importante en procesos industriales de biolixiviación y por ende, su estudio resulta de utilidad en relación con esta biotecnología. Uno de los componentes más abundantes e importantes de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas como A. ferrooxidans es el lipopolisacárido (LPS). Esta molécula consta de una parte integral hidrofóbica conocida como lípido A, y una parte hidrofílica dividida en dos, el “core” y el antígeno O. La síntesis de las distintas partes del LPS es catalizada por varias proteínas. Dentro de éstas, se encuentra la proteína RfaE, involucrada en la síntesis del “core” del LPS, la enzima Wzy, que polimeriza al antígeno O y la proteína Wzz, que determina el largo de cadena del antígeno O. Al ser la molécula más expuesta de la bacteria, el LPS está en contacto directo con el medio donde vive el microorganismo. Por lo tanto, interactúa directamente con eventuales metales presentes en el ambiente como el cobre, el oro, etc. Diversos estudios han revelado que modificaciones del LPS pueden afectar la adherencia de las bacterias a distintas superficies e incluso afectar la viabilidad de la célula. En base a estos antecedentes, para analizar si el LPS modifica su estructura y/o cantidad, se midieron mediante qRT-PCR los cambios transcripcionales de los genes wzy, wzz y rfaE de las cepas ATCC 23270 y ATCC 53993 de A. ferrooxidans, que codifican para las proteínas nombradas previamente, cuando la bacteria creció a distintas concentraciones de cobre. También se cuantificó y analizó la estructura del LPS de A. ferrooxidans. 2 Los resultados mostraron que la presencia de cobre provoca cambios transcripcionales significativos para los tres genes analizados en la cepa ATCC 23270 y sólo para el gen wzz en la cepa ATCC 53993. Tanto la estructura del LPS analizado, como el número de unidades repetidas del antígeno O, no presentaron cambios significativos en ambas cepas. La cantidad de LPS presente en la cepa ATCC 23270 es menor que en la cepa ATCC 53993, sin embargo, se observó un aumento parcial del LPS en la cepa ATCC 23270 cuando la bacteria crece a mayores concentraciones de cobre, mientras que la cepa ATCC 53993 no presentó cambios significativos en esta condición, sugiriendo que la cepa ATCC 23270 utilizaría el LPS como una forma de resistencia contra el cobre y que la cepa ATCC 53993 no aumentaría su cantidad de LPS, ya que de manera basal posee mayores cantidades de esta molécula. Estos resultados son una primera aproximación al posible rol que tendría el LPS en esta bacteria acidófila en la interacción con metales. / Acidithiobacillus ferrooxidans is a chemolithoautotrophic and acidophilic bacterium, involved in the microbial consortium capable of bioleaching metals such as copper. This microorganism has the ability to live at very high metal concentrations and therefore, plays a pivotal rol in bioleaching of minerals. One of the most abundant and important components of the outer membrane of Gram-negative bacteria such as A. ferrooxidans is the lipopolysaccharide (LPS). This molecule consists of an integral hydrophobic part known as lipid A, and a hydrophilic portion divided in to the “core” and the O-polysaccharide or O-antigen. The synthesis of the different parts of LPS is catalyzed by several proteins. Among these, RfaE protein is involved in the “core” synthesis of LPS. Wzy enzyme polymerizes the O antigen and Wzz protein is the O antigen chain lenght determinant. Being the most exposed molecule of the bacterium, LPS is in direct contact with the environment. Therefore, it can directly interact with the metals present in the environment. Some reports indicate that modifications of LPS can affect the attachment of bacteria to different surfaces and even their viability. Based on this background, to analyze whether the LPS structure and/or its quantity are modified in the presence of copper, transcriptional changes of wzy, wzz and rfaE genes from A. ferrooxidans ATCC 23270 and ATCC 53993, were measured in bacteria grown at different copper concentrations. The levels of LPS present in both strains of A. ferrooxidans were also quantified and their structure analyzed by electrophoresis in poliacrilamide gels. 4 The results showed significant transcriptional changes for the three genes analyzed in strain ATCC 23270 and only for the wzz gene in strain ATCC 53993. The LPS structure was analyzed by determining the number of repeated units of O antigen. No significant changes in the electrophoretic banding patterns were seen in both strains. The amounts of LPS present in strain ATCC 23270 was lower than that of strain ATCC 53993. However, the amounts of LPS were partially increased when strain ATCC 23270 was grown in high copper concentrations. On the contrary, strain ATCC 53993 did not show significant changes in the presence of the metal, suggesting that strain ATCC 23270 would use LPS as a way of copper resistance. Strain ATCC 53993 on the other hand, already has a higher basal amount of LPS. These preliminary results are a first approximation to study the posible role of LPS in its interaction with metals in this acidophilic bacteria.

Doctor en Ciencias mención en Microbiología / El cadmio es un metal pesado altamente tóxico para los sistemas biológicos. El estudio de microorganismos para la biorremediación de metales pesados, ha destacado a Cupriavidus metallidurans CH34, β-proteobacteria aislada desde instalaciones metalúrgicas, como modelo de resistencia a estos elementos. La biorremediación ex situ de metales pesados es comúnmente llevada a cabo en biorreactores de lecho fijo, donde los metales pesados en solución se concentran en la biomasa de comunidades de microorganismos adheridos a superficies llamadas “biopelículas”. El efecto de los metales pesados sobre la formación de biopelículas en C. metallidurans CH34 no ha sido descrito. Durante las últimas décadas, la vía de señalización mediada por un dinucleótido cíclico llamado “c-di-GMP” ha sido establecida como central en la regulación del estilo de vida bacteriano. La interacción de c-di-GMP con distintos receptores macromoleculares promueve del estilo de vida comunitario. Pese al rol fundamental de las biopelículas en los procesos de biorremediación, el efecto de los metales pesados sobre esta vía de señalización en bacterias ha sido poco estudiado. El objetivo de esta tesis es determinar el efecto del cadmio sobre la vía del c-di- GMP y la formación de biopelículas en C. metallidurans CH34. El cadmio inhibió la formación de biopelículas de C. metallidurans CH34. Esto se correlaciona con la descripción de una baja en los niveles de c-di-GMP tras la exposición a este metal pesado, concomitante con un aumento en la abundancia de un transcrito del gen urf2 de los operones de resistencia a mercurio Tn4378 (urf2.1) y Tn4380 (urf2.2), que codifica una potencial fosfodiesterasa. Ensayos de complementación con el gen urf2.2 de la cepa mutante nula P. aeruginosa PAO1 ΔrocR, carente de la fosfodiesterasa RocR, restituyeron la formación de biopelículas y concentración intracelular de c-di-GMP a niveles de la cepa silvestre. Estos resultados constituyen la primera evidencia de funcionalidad catalítica de la fosfodiesterasa codificada por el gen urf2, por lo que se denominó fosfodiesterasa Mrp (metal regulated phosphodiesterase). De forma coherente con la respuesta inhibitoria de formación de biopelículas mediada por la disminución de los niveles de c-di-GMP en C. metallidurans, niveles elevados de este segundo mensajero generados por una diguanilato ciclasa activa expresada en forma heteróloga, incrementaron la formación de biopelículas y la susceptibilidad a cadmio. / Cadmium is a highly toxic heavy metal for biologic systems. Ex situ heavy metal bioremediation is commonly carried out in fixed bed bioreactors in which heavy metals in solution are removed by adhered microbial communities in biofilms. Cupriavidus metallidurans CH34 is a model strain for heavy metal resistance and bioremediation. However, the effect of heavy metals on C. metallidurans CH34 biofilm formation has not been described. The signaling pathway mediated by the cyclic dinucleotide c-di-GMP is central in bacterial lifestyle regulation. c-di-GMP promotes biofilm lifestyle through the interaction with different receptors. Despite of the central role of biofilms on the bioremediation process, the effect of heavy metals over this signaling pathway has been poorly studied. Thus, the objective of this study was to assess the effect of cadmium on the c-di-GMP pathway and biofilm formation in C. metallidurans CH34. Cadmium exerted an inhibitory effect on C. metallidurans CH34 biofilm formation concomitant with a decrease of c-di-GMP levels. After cadmium exposure an increase in the transcription of the gene urf2 that codes for a phosphodiesterase and is located in the mercury resistance operons Tn4378 (urf2.1) and Tn4380 (urf2.2) was observed. Complementation assays with the urf2.2 gene in Pseudomonas aeruginosa PAO1 ΔrocR mutant null strain that is defective in RocR phosphodiesterase, restored biofilm formation and c-di-GMP intracellular concentration at wild type levels. This is the first evidence of catalytic functionality of the urf2 gene encoded phosphodiesterase, which was named Mrp por metal regulated phosphodiesterase. In agreement with the biofilm formation inhibition mediated by a c-di-GMP drop in C. metallidurans, high levels of this second messenger generated by an active diguanylate cyclase that was heterologously expressed, increased the biofilm formation and cadmium susceptibility of this bacterium.

Doctorado en Ciencias mención Microbiología. / Acidithiobacillus thiooxidans es una bacteria que obtiene energía metabólica y poder reductor a partir de la oxidación de compuestos reducidos de azufre. En estado natural, esta bacteria se encuentra junto con otros microorganismos participantes del consorcio de biolixiviación de sulfuros metálicos formando estructuras multicelulares llamadas biopelículas sobre la superficie de sulfuros minerales. Las células están embebidas en una matriz de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) las cuales se componen principalmente de exopolisacáridos, proteínas y lípidos. Se ha descrito que la solubilización de los minerales sulfurados metálicos está mediada por estos EPS. Sin embargo, la composición de los EPS y su rol exacto en la solubilización de sulfuros metálicos ha sido caracterizado solamente en la bacteria oxidadora de hierro y azufre Acidithiobacillus ferrooxidans, aunque las demás especies de Acidithiobacillus que son capaces de oxidar solamente compuestos reducidos del azufre son fundamentales en estos procesos de lixiviación. En base a estos antecedentes, nos propusimos caracterizar alguno de los EPS y los mecanismos moleculares involucrados en la formación de biopelículas en la especie modelo At. thiooxidans. En un trabajo previo, se identificó un gen putativo que codifica para una proteína de unión a c-di-GMP PelD, la cual está caracterizada en Pseudomonas aeruginosa formando parte de un complejo multiproteico de membrana involucrado en vii la biosíntesis del exopolisacárido Pel. Al analizar el contexto genético del gen pelD, se identificó un putativo operón con una estructura similar al operón canónico identificado en P. aeruginosa. El análisis comparativo entre los genomas disponibles de las bacterias acidófilas que están presentes en los entornos minerales ácidos reveló que este operón sólo está presente en los genomas de At. thiooxidans y At. caldus. Ante este resultado, este trabajo se enfocó en comprender cuál sería la importancia de este exopolisacárido en la formación de biopelículas de At. thiooxidans sobre la superficie de azufre elemental. La medición de los niveles de transcrito mediante qPCR mostró que los genes pelA, pelD y wcaG del putativo operón presentan un mayor de expresión en células adheridas que en células planctónicas. El análisis de azúcares de superficie mediante el uso de lectinas identificó la presencia de N-acetil-galactosamina y N-acetil-glucosamina. Tratando de dilucidar algunas de las señales que regulan la producción de Pel, se descubrió que la adición exógena de la molécula de Quorum Sensing (QS) 3-oxo-C8 AHL incrementa la transcripción de los genes pelA y pelD. Finalmente, se procedió a obtener una cepa mutante nula en el gen pelD mediante recombinación homóloga. Luego de analizar el DNA de esta cepa, se realizaron análisis de adherencia y formación de biopelículas sobre la superficie de azufre elemental mediante microscopía electrónica y de epifluorescencia. La mutación ΔpelD afectó la estructura de la biopelícula al reducir la presencia de N-acetil-galactosamina y N-acetilglucosamina en la superficie, pero adicionalmente provocó un incremento en la viii producción de estructuras filamentosas que rodean a las células. Para resolver la incógnita sobre la naturaleza de estas fibras, se realizaron análisis comparativos preliminares de la expresión de proteínas extracelulares. El análisis del sobrenadante de los cultivos y de las proteínas del EPS reveló un cambio en producción de proteínas secretadas al medio. En base a estos resultados es posible concluir que el exopolisacárido Pel producido por la bacteria biominera At. thiooxidans juega un rol estructural en la formación de biopelículas sobre la superficie de azufre elemental y que la regulación de su síntesis involucra a las vías del QS y del c-di-GMP. / Acidithiobacillus thiooxidans is a bacterium that obtains metabolic energy and reducing power from the oxidation of reduced sulfur compounds. In the natural state, this bacterium is found along with other microorganisms that are members of the metal sulfides bioleaching consortium forming multicellular structures called biofilms on the surface of mineral sulfides. The cells are embedded in a matrix of extracellular polymeric substances (EPS) which are composed mainly of exopolysaccharides, proteins and lipids. It has been described that the solubilization of the metal sulfide minerals is mediated by these EPS. However, the composition of the EPS and their exact role in the solubilization of metal sulfides has been characterized only in the iron and sulfur oxidizer bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans, although the other Acidithiobacillus species that are only capable of oxidizing reduced sulfur compounds are important in these leaching processes. Based on this background, we set out to characterize some of the EPS and the molecular mechanisms involved in biofilm formation in the model species At. thiooxidans. In a previous work it was identified a putative gene encoding a c-di-GMP binding PelD protein, which is characterized as part of a multiprotein membrane complex involved in Pel exopolysaccharide biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa. x When we were analyzing the genetic context of the pelD gene, a putative operon with a structure similar to the canonical operon identified in P. aeruginosa was identified. Comparative analysis between available genomes of acidophilic bacteria that are present in acidic mineral environments revealed that this operon is only present in the genomes of At. thiooxidans and At. caldus. Given this result, this work focused on understanding the importance of this exopolisaccharide in biofilm formation of At. thiooxidans on the surface of elemental sulfur. Measurement of transcript levels by qPCR showed that pelA, pelD and wcaG genes of the putative operon exhibit a greater expression in attached cells than in planktonic cells. The analysis of surface sugars by the use of lectins identified the presence of N-acetyl-galactosamine and N-acetyl-glucosamine. Trying to elucidate some of the signals that regulates the production of Pel, it was discovered that the exogenous addition of Quorum Sensing (QS) molecule of 3-oxo-C8 AHL increases the transcription of pelA and pelD genes. Finally, a pelD gene null mutant strain was obtained by homologous recombination. After analyzing the DNA of this strain, adherence and biofilm formation analysis were performed on the elemental sulfur surface by electronic and epifluorescence microscopy. The ΔpelD mutation affected the structure of the biofilm by reducing the presence of N-acetyl-galactosamine and N-acetyl glucosamine on the surface, but additionally caused an increase in the production of fibrillar structures xi surrounding the cells. To solve the unknown about the nature of these fibers, preliminary comparative analysis of extracelluar protein expression were performed. Analysis of the culture supernatant and proteins from EPS revealed a change in production of secreted proteins to the medium. Based on these results it is possible to conclude that the Pel exopolisaccharide produced by the biomining bacterium At. thiooxidans plays a structural role at biofilm formation on the surface of elemental sulfur and that the regulation of its synthesis involves QS and c-di-GMP pathways. / Proyectos regulares Fondecyt 1120295 y 1160702 y beca Conicyt 21120064 por aportar el financiamiento durante el desarrollo de la tesis.