VINHOTE, Juliana Freire Chagas. Ação tripanocida de um mastoparano de Polybia paulista e seu possível mecanismo de ação. 2015. 102 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-10-26T16:49:04Z
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Previous issue date: 2015 / Chagas disease, a neglect
ed disease, is a parasitic infection caused by
Trypanosoma cruzi (T. cruzi) and is endemic in several countries. In Brazil, only
benznidazole is used for treating the disease. In this context, the therapeutic potential
of toxins is increasingly gaining gro
und and stirring interest in the scientific
community. The poisons of invertebrates have become intriguing as a source of
bioactive substance. The mastoparan, the most widely described class of peptides
isolated from the venom of wasps, already shows diffe
rent biological activities. Thus,
isolated peptides have attracted scientific interest as a source of molecular model for
the possible development of new drug therapies. This study investigated the effect of
mastoparan peptide (MP) isolated from the venom
of a Polybia paulista wasp on the
Y strain of T. cruzi and its possible mechanism of action. Epimastigote forms of T.
cruzi were grown, treated with various concentrations of MP, and incubated for 24,
48, and 72 hours. Trypomastigote forms of T. cruzi obta
ined by LLCMK2 cells
infected were subcultured, treated with various concentrations of MP, and incubated
for 24 hours. To investigate the involvement of reactive oxygen species (ROS) in the
mastoparan cytotoxic effect on T. cruzi epimastigotes, plates were
incubated with
IC50 of 24 MP; an analysis of fluorescence emission was performed via flow
cytometry after adding dichlorofluorescein (DCF). The mastoparan effect on the
mitochondrial membrane potential of epimastigotes was tested with rhodamine 123.
Cytot
oxicity was assessed on RAW 264.7 cells, and the viability of macrophages was
determined using the microculture tetrazolium (MTT) assay. In the study of molecular
docking, the three dimensional structure of the mastoparan was originally obtained
from the p
rimary sequence specific program. After analyzing the binding sites of the
peptide and T. cruzi glyceraldehyde 3
-
phosphate dehydrogenase (TcGAPDH)
enzyme, the crystal structure of the TcGAPDH
-
chalepina complex was used for
comparison. The mastoparan inhibi
ted the growth of T. cruzi epimastigotes, with an
IC50 of 102 μg/ml, 53.95 μg/ml, and 58.51 μg/ml for 24, 48, and 72 hours of
incubation, respectively. In the analysis of the ROS generation, there was a
significant increase in the relative fluorescence int
ensity compared to the control
group. The peptide change had the potential of mitochondrial membrane of the
parasite. For trypomastigotes, the IC50 was 8.83 μg/ml after 24 hours of incubation.
The cytotoxicity of mastoparan evaluated in macrophages did not
induce significant
cell death in the different concentrations studied. In the docking study, coupling
mastoparan was evidenced in TcGAPDH, showing different binding sites residue of
the enzyme's active center amino acids and comparing the similar position
occupied
by the molecule in TcGAPDH
-
chalepina. It follows that the mastoparan showed
trypanocidal activity involving the involvement of oxidative stress and changes in
membrane potential without displaying cytotoxic cells; the macrophages seem to
inhibit
TcGAPDH T. cruzi. Therefore, the mastoparan stands out as an important
bioactive molecule against parasites. / A doença de Chagas, considerada uma doença negligenciada, é uma infecção parasitária causada pelo Trypanosoma cruzi e endêmica em diversos países. No Brasil, apenas o Benzonidazol é usado para o tratamento da doença. Nesse contexto, o potencial terapêutico das toxinas vem cada vez mais conquistando espaço e despertando grandes interesses da comunidade científica. Os venenos de invertebrados têm apresentado grande interesse como fonte de substâncias bioativas. Os mastoparanos, a classe mais amplamente descrita de peptídeos isolados a partir da peçonha de vespas, ja evidenciaram diferentes atividades biológicas. Assim, os peptídeos isolados têm despertado interesse científico como fonte de modelos moleculares para o possível desenvolvimento de novas terapias farmacológicas. Este estudo investigou o efeito do peptideo mastoparano (MP) isolado do veneno da vespa Polybia paulista sobre cepa Y de Trypanosoma cruzi e seu possível mecanismo de ação. Formas epimastigotas de T. cruzi foram cultivadas, tratadas com diferentes concentrações de MP e incubadas durante 24, 48 e 72 horas. Formas tripomastigotas de T. cruzi obtidas através de infecção de células LLCMK2 foram subcultivadas, tratadas com diferentes concentrações de MP e incubadas durante 24 horas. Para investigar a participação das espécies reativas de oxigênio (ERO) no efeito citotóxico do mastoparano sobre formas epimastigotas de T.cruzi, placas foram incubadas com a CI50 de 24h de MP e a análise da emissão de fluorescência foi realizada em citometria de fluxo após adição de DCF. O efeito de mastoparano sobre o potencial de membrana mitocontrial das formas epimastigotas foi realizado pelo ensaio com rodamina 123. A citotoxicidade foi avaliada sobre celulas Raw 264.7 e a viabilidade dos macrófagos foi determinada utilizando o ensaio com MTT. No estudo de Docking molecular, obteve-se inicialmente a estrutura tridimensional do mastoparano a partir da sequência primária em programa específico. Após análise dos sítios de ligação entre peptídeo e enzima TcGAPDH, a estrutura cristalográfica do complexo TcGAPDH-chalepina foi utilizada para comparação. O mastoparano inibiu o crescimento das formas epimastigotas de T. cruzi, apresentando uma CI50 de 102 µg/mL, 53,95 µg/mL e 58,51 µg/mL para 24, 48 e 72 horas de incubação respectivamente. Na análise da produção de espécies reativas houve um aumento significativo na intensidade relativa de fluorescência, quando comparado ao grupo controle. O peptideo alterou o potencial da membrana mitocondrial do parasita. Para as formas tripomastigotas a CI50 foi 8,83 µg/mL após 24h de incubação. A citotoxidade do mastoparano avaliada em macrófagos não induziu morte celular significativa nas diferentes concentrações estudadas. No estudo de docking, foi evidenciado o acoplamento do mastoparano na TcGAPDH, demonstrando os diferentes sítios de ligação dos resíduos de aminoácidos do centro ativo da enzima e comparando a semelhança na posição ocupada pela molécula chalepina na TcGAPDH. Conclui-se que o mastoparano apresentou atividade tripanocida envolvendo a participação do estresse oxidativo e alteração do potencial de membrana sem apresentar citotóxica em células de macrófagos e parece inibir a TcGAPDH de T. cruzi. Portanto, o mastoparano se destaca como importante molécula bioativa contra os parasitas.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.repositorio.ufc.br:riufc/13766 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Vinhote, Juliana Freire Chagas |
| Contributors | Martins, Alice Maria Costa |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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