Em caso de envenenamento ofídico, o tratamento no Brasil hoje é realizado pela administração de soros geralmente produzidos por equinos, que apresentam eficácia limitada: são úteis para os efeitos sistêmicos, mas não inibem efetivamente a evolução dos danos locais, podem causar reações adversas e apresentam alto custo de produção. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), trata-se de uma doença negligenciada pelas autoridades científicas mundiais. O presente projeto, em parceria com o Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais da Fundação Oswaldo Cruz - Rondônia, propõe a produção por Escherichia coli de fragmentos de anticorpos de cadeia pesada de camelídeos, denominados VHH, contra as toxinas do veneno de Bothrops jararacussu, utilizando biorreator. Neste trabalho há interesse em produzir VHH, através da otimização do crescimento desta E. coli. A cinética do crescimento bacteriano foi realizada em shaker orbital sob diferentes condições, variando tamanho do frasco, rotação do shaker, composição do meio de cultura e concentração de substrato; e em biorreatores, alternando meios de cultura e modo de operação do reator (descontínuo e descontínuo alimentado), alterando a vazão de alimentação (linear e exponencial) O processo cinético é fortemente limitado pela formação de acetato, por condições auxotróficas da célula e pela transferência de oxigênio. Nos ensaios em frascos agitados, uma melhor condição de crescimento foi obtida utilizando frascos de 1 L, sob rotação a 270 rpm e 5,0 g/L de glicose. Nos ensaios em reator, quando operados em batelada obtiveram-se cerca 5,5 g/L de células finais, contra 9,3 g/L de células em batelada alimentada com vazão constante. Um maior crescimento foi ainda obtido em um reator de 2 L em regime de batelada alimentada exponencialmente. O biorreator varia a agitação do meio e mantém um nível pré-definido de oxigênio dissolvido, evitando a limitação de oxigênio e controlando a oferta de glicose para o crescimento celular. Neste processo, atingimos 25,6 g/L de células e 0,35 g/L de proteína total após purificação, utilizando meio M9 suplementado. / Nowadays in Brazil, the treatment for snakebite poisoning is carried out by the administration of horse sera, which have limited effectiveness: they are useful for systemic effects, but do not effectively inhibit local damage, cause adverse reactions, and present high production costs. According to the WHO, this disease is neglected by the world`s scientific authorities. This project, in partnership with the Institute for Research in Tropical Diseases of Oswaldo Cruz Foundation - Rondonia, proposes the production of heavy chain antibody fragments from camelids, called VHH, using Escherichia coli, to be used against the toxins from the Bothrops jararacussu poison, using a bioreactor. This work is interested in producing VHH through the use of E. coli. The kinetics of bacterial growth were performed in orbital shaker under different conditions, varying vial size, shaker rotation, composition of the culture medium and substrate concentration; and bioreactors, alternating culture media and operation mode of reactor (batch and fed-batch), changing feeding rate (linear and exponential). The kinetic process is statically bound to acetate formation, auxotrophic conditions of the cell and oxygen transfer. In assays in shaken flasks, an output of 270 rpm and 5.0 g/L of glucose. In reactor runs, when operated in a batch 5.5 g/L of final cells were obtained, against 9.3 g/L of final cells in fed-batch with constant flowrate. A larger value was obtained in an exponentially fed-batch reactor of 2 L. The bioreactor varies the agitation of oxygen and controls glucose addition for cell growth. In this process, 25.6 g/L cells and 0.35 g/L total protein after purification were reached, using supplemented M9 medium.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-05112018-142057 |
| Date | 26 June 2018 |
| Creators | Medeiros, Luan Merida de |
| Contributors | Tonso, Aldo |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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