Aunque tradicionalmente las dificultades asociadas a su estudio han subestimado la importancia de los virus en los ecosistemas, hoy en día el desarrollo de nuevas metodologías nos ha hecho comprender que estos juegan un papel relevante a nivel global, sobre todo en los océanos. La secuenciación del genoma vírico de una muestra ambiental (la virómica) y su posterior reconstrucción (ensamblaje de genomas), ha permitido ampliar el número de virus marinos conocidos, sin embargo, también han puesto de manifiesto la enorme diversidad de genomas víricos que continúan sin ser reconstruidos. En esta tesis, la novedosa metodología de Single-virus genomics (SVGs), una técnica en la que se separan virus mediante sorting y se amplifica y secuencia su genoma de forma individual, fue aplicada con éxito sobre muestras marinas, desvelándose el genoma de virus marinos, previamente desconocidos, a pesar de ser altamente abundantes a lo largo de todos los océanos del planeta. El motivo por el que la virómica no ha podido reconstruir estos genomas fue analizado también en la tesis y se le atribuyó a la (micro-)diversidad de estas abundantes poblaciones víricas. Uno de estos virus obtenidos por SVG, el vSAG 37-F6, resultó ser el más abundante en los océanos. Diferentes métodos in silico, basados en análisis de k-mer, espaciadores CRISPR y búsqueda de ARNt, fueron empleados para tratar de identificar su huésped, sin embargo, no dieron resultado, por lo que se diseñó una aproximación experimental. Se diseñaron unos primers de PCR, específicos para el vSAG 37-F6 y se probaron en una colección de células sorteadas individualmente cuyo genoma había sido amplificado (SAGs). Tras comprobar la correcta amplificación (no inespecificidades) en uno de estos SAGs, se secuenció su genoma, mostrando que estaba relacionado con los Pelagibacteriales, por lo que el vSAG 37-F6 se identificó como un pelagifago. Corroborando este resultado 3 contigs diferentes, similares al vSAG 37-F6 fueron encontrados en otros 3 SAGs identificados también como Pelagibacter sp, obtenidos cada uno de ellos en diferentes localizaciones (Océanos Atlántico y Pacífico), y en tres experimentos y trabajos diferentes. Estos Pelagifagos similares al 37-F6 estaban poco relacionados con los obtenidos por técnicas dependientes de cultivo. La abundancia de los virus en muestras ambientales es tradicionalmente estimada de forma relativa mediante el reclutamiento de fragmentos virómicos. Sin embargo, la ausencia de marcadores específicos dificulta el empleo de métodos para calcular su abundancia de forma absoluta, como se hace con los procariotas. En el tercer capítulo de esta tesis, se muestra la aplicación de la técnica de droplet digital PCR (ddPCR) para calcular la abundancia absoluta de 2 pelagifagos, el vSAG 37-F6, y el HTVC010P. Además, son evaluados los pasos críticos de esta metodología, como es el diseño de primers específicos, o la correlación matemática para su cálculo. Las abundancias absolutas de ambos virus fueron calculadas en tres muestras ambientales diferentes, dos del Mar Mediterráneo, y una del Atlántico Norte, procedente del Golfo de Maine (Estados Unidos). La pareja de primers empleada con el vSAG 37-F6 fue diseñada siguiendo el procedimiento propuesto en este trabajo, mientras que para el HTVC010P se empleó una pareja de primers obtenida de la bibliografía. Los valores de abundancia obtenidos estuvieron comprendidos entre los valores de 1,270-14,400 virus mL-1 y de 360 a 8,510 virus mL-1 para el HTVC010P y el vSAG 37-F6 respectivamente. Sin embargo, la secuenciación de los amplicones obtenidos por PCR, mostró una sobreestimación del 6% para los primers del HTVC010P, pero no para los del vSAG 37-F6. Los dos últimos apartados de esta tesis se corresponden con dos trabajos que están actualmente siendo desarrollados por el doctorando. En el primero de ellos se analiza la (micro-)diversidad de las poblaciones del vSAG 37-F6 desde varios puntos de vista. Y para finalizar la técnica de SVGs es aplicada en muestras marinas de profundidad, de las que poco se conoce actualmente. / La presente tesis ha sido financiada por el Ministerio de Economía y competitividad español (refs. CGL2013-40564-R and SAF2013-49267-EXP), por la Generalitat Valenciana (ref. ACOM/2015/133 and ACIF/2015/332), y por la Gordon and Betty Moore Foundation (ref. 5334).
Identifer | oai:union.ndltd.org:ua.es/oai:rua.ua.es:10045/118218 |
Date | 13 September 2019 |
Creators | Martinez-Hernandez, Francisco |
Contributors | Martinez-Garcia, Manuel, Universidad de Alicante. Departamento de Fisiología, Genética y Microbiología |
Publisher | Universidad de Alicante |
Source Sets | Universidad de Alicante |
Language | English |
Detected Language | Spanish |
Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
Rights | Licencia Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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