Ein sehr organisiertes vielschichtiges Gewebe im Gehirn von Säugetieren ist der Neokortex, der höhere kognitive Funktionen ausübt wie Erlernen einer Sprache, Denken und räumliches Vorstellungsvermögen. Während der Evolution hat sich der Neokortex vergrößert, um den komplexen kognitiven Bedarf von höher entwickelten Tieren zu bewältigen. Es wird angenommen, dass diese kortikale Expansion primär in der Balance zwischen Proliferation und Differenzierung von neuralen Stammzellen und deren Vorläuferzellen begründet ist. Diese Prozesse sind sehr stark programmiert in Ort und Zeit, was viele Fragen über die involvierten molekularen Netzwerke aufwirft. In den letzten zwei Jahrzehnten haben sich lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs) als attraktive Ziele in der Entwicklungsbiologie dargestellt. Diese Moleküle haben unsere Wahrnehmung von der funktionalen Einheit einer Zelle revolutioniert, da sie bekannt dafür sind, deren Funktion mittels ihrer RNA Struktur auszuüben. Im Gegensatz zu microRNAs, die ihre Funktion über die Regulation von protein-kodierenden Genen auf post-transkriptionaler Ebene ausführen, agieren lncRNAs unterschiedlicher. Vor allem im Gehirn, dem Organ, was die größte Anzahl von lncRNAs exprimiert und das höchste Verhältnis von Gewebe- und Zell-spezifischen lncRNAs besitzt, wurde nachgewiesen, dass sie in fast jedem Prozess während der Entwicklung und bei Erwachsenen involviert sind. Mit dem Ziel eines besseren Verständnisses der molekularen Mechanismen der Gehirnentwicklung, habe ich angestrebt neue Rollen für lncRNAs in der Neurogenese zu identifizieren. Dafür habe ich Gebrauch von einem wirksamen genetischen Instrument gemacht, das zuvor in unserem Labor erzeugt wurde: ein Transkriptom von einer Mauslinie, die es ermöglicht, proliferierende, differenzierende und ausdifferenzierte Zellen zu sortieren. Die Analyse der differentiellen Expression von lncRNAs in den drei Zelltypen enthüllte interessante Kandidaten, die möglicherweise eine Rolle in der Neurogenese spielen. Die Manipulation dieser Kandidaten wurde in vivo getestet durch in utero Elektroporation. In dieser Studie habe ich Casc15 als Regulator von neuraler Stammzellproliferation und neuronaler Migration identifiziert. Überexpression von Casc15 im entwickelnden Kortex verursachte eine Deregulierung von Genen, die in der Entwicklung des Nervensystems und Zellteil-Morphogenese involviert sind. Insbesondere herunterregulierte Gene nach Casc15 Überexpression sind physiologisch angereichert in Neuronen. Diese schließen Gene ein, die verantwortlich für neuronale Migration und Reifung verantwortlich sind. Es wurde gezeigt, dass Casc15 Tbr2, einen neurogenen Transkriptionsfaktor, auf Protein- aber nicht mRNA-Level verringert. Außerdem wurde mittels einer Serie von bioinformatischen Programmen herausgefunden, dass Casc15 eine differentielle Gen-Isoform Benutzung im entwickelnden Gehirn verursacht, was eine Interaktion von Casc15 mit Spleißfaktoren suggeriert. Die Effekte von Casc15 auf Gen- oder Transkript-Expression kann nicht völlig erklärt werden durch Casc15’s Rolle in Neurogenese. Besonders sein Effekt auf Proteintranslation und –stabilität muss adressiert werden. Alles in allem zeigen meine Daten, wenn auch mechanistisch nicht sehr eindeutig, dass Casc15 ein wichtiger Regulator in der Gehirnentwicklung ist. Weiterführende Experimente sind nötig, um die molekularen Aspekte der Casc15 Funktionen zu erörtern.:Introduction 1
1.1 Development of the mammalian neocortex 2
1.2 Neurogenesis in the neocortex 4
1.2.1 Neural stem cells 4
1.2.2 Transient amplifying cells 7
1.2.3 Neurogenesis 9
1.3 Molecular control of neurogenesis in neocortex 11
1.3.1 Signaling pathways influencing the onset and progression of neurogenesis 12
1.3.2 Transcriptional control of neurogenesis 13
1.3.3 Epigenetics, Post-‐translational modifications and more 15
1.4 Long non-‐coding RNAs 16
1.4.1 General characteristics of lncRNAs 17
1.4.2 Versatile mechanisms of lncRNAs 20
1.4.3 Expression patterns of lncRNAs 21
1.4.4 lncRNAs in neurogenesis 23
1.5 Btg2RFP/Tubb3GFP mouse line to study cortical development 25
1.6 Aim of the study 28
2 Materials and Methods 29
2.1 Materials 30
2.1.1 Chemicals, buffers and culture media 30
2.1.2 Antibodies 31
2.1.3 Primers 32
2.1.4 Mouse strains 34
2.1.5 Bacterial Strains 34
2.1.6 Vectors 34
2.1.7 Kits and enzymes 35
2.2 Methods 35
2.2.1 Generation of plasmid 35
2.2.2 In utero electroporation 35
2.2.3 Mouse sample collection and treatment 36
2.2.4 Immunohistochemistry 36
2.2.5 Image acquisition and processing 37
2.2.6 Reverse transcription 37
2.2.7 Library preparation and supplemental bioinformatic analyses 37
2.2.8 Quantitative-‐Reverse Transcriptase-‐PCRs 39
2.2.9 Bioinformatic analysis 39
2.2.10 Statistical analysis 40
3 Results 41
3.1 Selection of potential regulators of neurogenesis 42
3.1.1 Differential expression analysis for RNA seq data 42
3.1.2 LincRNAs for in vivo manipulation 44
3.2 In vivo manipulation of K13, K10 and Casc15 48
3.2.1 K13 overexpression does not alter progenitors/neurons distribution in the cortex 49
3.2.2 K10 might affect migration of neurons in the developing cortex 50
3.2.3 Casc15 disrupted the distribution of cells across the four cortical layers 50
3.3 Characterization of the cellular phenotype of Casc15 52
3.3.1 Casc15 delays neuronal migration 52
3.3.2 Casc15 does not alter progenitors migration 54
3.3.3 Casc15 does not induce direct neurogenesis 54
3.3.4 Casc15 causes subtle changes on cell distribution after 24 hours 56
3.3.5 Effect of Casc16 on progenitors fate 58
3.4 Molecular effects of Casc15 61
3.4.1 Casc15 minimally changes gene expression in the developing cortex 61
3.4.2 Casc15 changes gene exon usage 64
4 Discussion 68
4.1 Casc15 is a potential regulator of neurogenesis 69
4.1.1 Casc15 induces proliferation of progenitors in the developing cortex 70
4.1.2 Casc15 delays neuronal migration in the developing cortex 71
4.2 Molecular aspects of Casc15 in neurogenesis 72
4.2.1 Casc15 roles in neurogenesis cannot be explained in light of changes in gene expression 73
4.2.2 Casc15 changes the transcriptome at an isoform level 76
4.3 Concluding remarks 78
5 Appendix 79
6 Bibliography 87
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:73722 |
| Date | 03 February 2021 |
| Creators | Tayel, Sara |
| Contributors | Ader, Marius, Buchholz, Frank, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | English |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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