Viele Bacillus Stämme sekretieren Phytasen, diese katalysieren die Dephosphorylierung von myo-Inositolhexakisphosphat (phytate). Das monocystronische phyC Gen aus dem im Boden lebenden Bacillus amyloliquefaciens FZB45 konnte als Teil des, durch Phosphatmangel induzierbaren, PhoPR-Regulons identifiziert werden. Der Transkriptionsstart des SigmaA-abhängigen Promotors wurde 27 bp upstream von Translationsstart bestimmt. Der Promotor weist jedoch eine ungewöhnliche Struktur auf, da die –35 und die –10 Region durch ein 21 bp Fenster voneinander getrennt sind. Die in vitro Transkriptionsanalyse zeigte, dass PhoP-P für die Initiation der phyC-Transkription notwendig ist. Die PhoP-Bindungsstellen der meisten B. subtilis Promotoren, die durch PhoP aktiviert werden, besitzen mindestens vier TTAACA-ähnliche Sequenzmotive, welche durch 5-6 bp- Intervalle getrennt sind. Die upstream Region von phyC aus B. amyloliquefaciens FZB45 weicht von dieser Struktur ab. Hier konnten nur zwei solcher Motive, die für die Bindung eines PhoP-Dimeres zuständig sind und die Positionen -47 und -35 überlagern, identifiziert werden. Ein weiteres Motiv befindet sich zwischen -13 und –8 und überlappt um eine Base mit der –10 Region. Die Funktionen der drei Bindungsstellen konnten durch DNaseI-Footprinting ermittelt werden. Ein PhoP-Dimer besetzt die –35 Region und dirigiert dabei die RNA-Polymerase wahrscheinlich in Richtung –10 Region. Durch die Bindung von PhoP an die PhoP-Erkennungsstelle bei –10 wird die Transkription gehemmt. Diese PhoP-vermittelte duale Kontrolle des phyC-Promotors scheint bis lang einzigartig für Pho-Regulongene zu sein. Der globale Regulator AbrB konnte als weiterer Repressor des phyC identifiziert werden. Die Bindungsstelle befinden sich upstream von –147 und downsteam von +29, müssen aber in weiteren Experimenten genauer spezifiziert werden. Diese Arbeit stellt als erste die Modelle der phyC-Regulation durch PhoP und AbrB vor. / Several Bacillus strains secrete phytase, an enzyme catalysing dephosphorylation of myo-inositol hexakisphosphate (phytate). The monocistronic phyC (phytase) gene from environmental Bacillus amyloliquefaciens FZB45 was identified as a member of the phosphate-starvation inducible PhoPR regulon. The transcriptional start was determined downstream of a sigmaA-like promoter region located 27 bp upstream of the translation start codon. Inspection of the phyC promoter sequence revealed an unusual structure, since the -35 and -10 region are separated by a window of 21 bp. In vitro transcription analysis established that PhoP-P is necessary to initiate the transcription from phyC promoter. PhoP binding boxes occurring in most B. subtilis promoters activated by PhoP consist of at least four TTAACA-like sequences repeated at intervals of 5-6 bps. The upstream region of the B. amyloliquefaciens FZB45 phyC gene deviates from this general architecture in that there is only one appropriate binding site for the dimeric PhoP protein, which consists of two motives centered at -47 and -35 and separated by five base pairs. A single PhoP binding site is located at -13 to -8, nearly matching the -10 consensus. Functionality of the three PhoP binding boxes was demonstrated by DNaseI footprinting suggesting that a pair of dimeric PhoP molecules cover the -35 region directing the RNA-polymerase to the –10 region. Binding of PhoP at a single PhoP binding site covering the -10 consensus repress the transcription. It seems to be a unique feature of the phyC promoter structure and has not been reported for any other member of the PhoPR regulon, previously. Furthermore an inhibitory effect via AbrB, a global regulator, could be verified. The binding regions could be determine upstream of –147 and downstream of +29, but have to be specify in further experiments. This work presents for the first time the models for the regulation of phyC in Bacillus via PhoP and AbrB.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/16202 |
| Date | 17 October 2006 |
| Creators | Makarewicz, Oliwia |
| Contributors | Stülke, Jörg, Borriss, Rainer, Eitinger, Thomas |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | German |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
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