Flavinmononukleotid (FMN) und Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD) gehören zu den wichtigsten Redox-Coenzymen und sind an zentralen Stoffwechselprozessen aller Organismen beteiligt. Sie entstehen aus Riboflavin (Vitamin B2). Das bifunktionale RIBA Enzym, das Peptiddomänen für die GTP Cyclohydrolase II (GCHII) und 3,4-Dihydroxy-2-Butanon-4-Phosphat-Synthase (DHBPS) Aktivität umfasst, führt die beiden ersten Schritte der Riboflavin Biosynthese in Pflanzen durch. Die RIBA Proteine werden durch drei Gene in Arabidopsis thaliana und anderen Blütenpflanzen kodiert. Eines der Ziele war es, die physiologischen Rollen der drei RIBA Isoformen aufzuklären. Detaillierte enzymatische Untersuchungen wurden mit rekombinanten RIBA Proteinen IN VITRO durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass RIBA2 und RIBA3 jeweils die GCHII oder die DHBPS Aktivität verloren haben. Des Weiteren konnte die Phosphorylierung von RIBA1, sowie die Hemmung von dessen GCHII Aktivität durch FMN nachgewiesen werden. Ein Knockout von RIBA1 führte zu Embryoletalität. Die schrittweise Reduzierung des RIBA1 Proteingehaltes in Arabidopsis, welches zu einem verringerten Flavingehalt führte, ergab einen schwerwiegenden Bleichungsphänotyp. Die konstitutive Antisense-Mutante, sowie das Verfahren des Virus-induzierten Gen-„Silencing“ wurden verwendet, um den durch RIBA1-Mangel hervorgerufenen Flavin-Defizienz-Effekt zu beschreiben. Eine Metabolomics Analyse ergab, dass die Abnahme des Flavingehaltes zu einer Deregulierung verschiedener Zitronensäurezyklus assoziierten Flavoenzyme und zu einer starken Reduktion der katabolischen Kapazität diverser Aminosäuren führt, während flavinabhängige Stickstoffassimilationsprozesse eher priorisiert wurden. Diese Arbeit leistet einen Beitrag zur Erweiterung des Kenntnisstands über den pflanzlichen Riboflavin Biosyntheseweg, sowie zum Verständnis über die Folgen von Flavinmangel in Pflanzen. Darüber hinaus wird hier der erste Versuch zu Erhöhung des Vitamin B2-Gehalt in Pflanzen beschrieben. / Flavin mononucleotide (FMN) and Flavin adenine dinucleotide (FAD) belong to the main redox coenzymes and are involved in central metabolic processes. They derive from riboflavin also referred to as vitamin B2. The bifunctional RIBA enzyme, which comprises peptide domains for GTP cyclohydrolase II (GCHII) and 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase (DHBPS) activity, performs the two initial steps of riboflavin biosynthesis in plants. Three genes encode RIBA proteins in Arabidopsis thaliana and many other flowering plants. One of the main aims of this study was to elucidate the physiological roles of the three RIBA isoforms. Detailed enzymatic studies were performed with recombinant RIBA proteins IN VITRO. It revealed for RIBA2 and RIBA3 the loss of either GCHII or DHBPS activity, respectively. The phosphorylation of RIBA1 as well as the inhibition of its GCHII activity by FMN could be demonstrated. A knockout of RIBA1, encoding the dominant RIBA isoform, led to embryo lethality. The gradual reduction of the RIBA1 protein content in Arabidopsis was associated with reduced flavin amounts and a severe bleaching phenotype that was caused by the gradual loss of pigments during leaf development. Flavin deficiency effects caused by RIBA1 depletion were characterised with a constitutive antisense mutant and the virus induced gene silencing method. A comprehensive metabolite profiling, revealed that the loss of almost one third of total flavin content led to a deregulation of several citric acid cycle-associated flavoenzymes. Moreover, a severe reduction of the catabolic capacity of numerous amino acids is seen, while seemingly flavin-dependent processes of the nitrogen assimilation are prioritised. In summary, this thesis contributes to the extended knowledge about the riboflavin biosynthesis pathway as well as to the understanding about consequences of flavin deficiency in plants. Moreover, the first attempt to increase the vitamin B2 content in plants is presented.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/18177 |
| Date | 10 June 2016 |
| Creators | Hiltunen, Hanna-Maija |
| Contributors | Grimm, Bernhard, Buckhout, Thomas, Fernie, Alisdair |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Lebenswissenschaftliche Fakultät |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | Namensnennung - Keine Bearbeitung, http://creativecommons.org/licenses/by-nd/3.0/de/ |
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