Flavinmononukleotid (FMN) und Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD) gehören zu den wichtigsten Redox-Coenzymen und sind an zentralen Stoffwechselprozessen aller Organismen beteiligt. Sie entstehen aus Riboflavin (Vitamin B2). Das bifunktionale RIBA Enzym, das Peptiddomänen für die GTP Cyclohydrolase II (GCHII) und 3,4-Dihydroxy-2-Butanon-4-Phosphat-Synthase (DHBPS) Aktivität umfasst, führt die beiden ersten Schritte der Riboflavin Biosynthese in Pflanzen durch. Die RIBA Proteine werden durch drei Gene in Arabidopsis thaliana und anderen Blütenpflanzen kodiert. Eines der Ziele war es, die physiologischen Rollen der drei RIBA Isoformen aufzuklären. Detaillierte enzymatische Untersuchungen wurden mit rekombinanten RIBA Proteinen IN VITRO durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass RIBA2 und RIBA3 jeweils die GCHII oder die DHBPS Aktivität verloren haben. Des Weiteren konnte die Phosphorylierung von RIBA1, sowie die Hemmung von dessen GCHII Aktivität durch FMN nachgewiesen werden. Ein Knockout von RIBA1 führte zu Embryoletalität. Die schrittweise Reduzierung des RIBA1 Proteingehaltes in Arabidopsis, welches zu einem verringerten Flavingehalt führte, ergab einen schwerwiegenden Bleichungsphänotyp. Die konstitutive Antisense-Mutante, sowie das Verfahren des Virus-induzierten Gen-„Silencing“ wurden verwendet, um den durch RIBA1-Mangel hervorgerufenen Flavin-Defizienz-Effekt zu beschreiben. Eine Metabolomics Analyse ergab, dass die Abnahme des Flavingehaltes zu einer Deregulierung verschiedener Zitronensäurezyklus assoziierten Flavoenzyme und zu einer starken Reduktion der katabolischen Kapazität diverser Aminosäuren führt, während flavinabhängige Stickstoffassimilationsprozesse eher priorisiert wurden. Diese Arbeit leistet einen Beitrag zur Erweiterung des Kenntnisstands über den pflanzlichen Riboflavin Biosyntheseweg, sowie zum Verständnis über die Folgen von Flavinmangel in Pflanzen. Darüber hinaus wird hier der erste Versuch zu Erhöhung des Vitamin B2-Gehalt in Pflanzen beschrieben. / Flavin mononucleotide (FMN) and Flavin adenine dinucleotide (FAD) belong to the main redox coenzymes and are involved in central metabolic processes. They derive from riboflavin also referred to as vitamin B2. The bifunctional RIBA enzyme, which comprises peptide domains for GTP cyclohydrolase II (GCHII) and 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase (DHBPS) activity, performs the two initial steps of riboflavin biosynthesis in plants. Three genes encode RIBA proteins in Arabidopsis thaliana and many other flowering plants. One of the main aims of this study was to elucidate the physiological roles of the three RIBA isoforms. Detailed enzymatic studies were performed with recombinant RIBA proteins IN VITRO. It revealed for RIBA2 and RIBA3 the loss of either GCHII or DHBPS activity, respectively. The phosphorylation of RIBA1 as well as the inhibition of its GCHII activity by FMN could be demonstrated. A knockout of RIBA1, encoding the dominant RIBA isoform, led to embryo lethality. The gradual reduction of the RIBA1 protein content in Arabidopsis was associated with reduced flavin amounts and a severe bleaching phenotype that was caused by the gradual loss of pigments during leaf development. Flavin deficiency effects caused by RIBA1 depletion were characterised with a constitutive antisense mutant and the virus induced gene silencing method. A comprehensive metabolite profiling, revealed that the loss of almost one third of total flavin content led to a deregulation of several citric acid cycle-associated flavoenzymes. Moreover, a severe reduction of the catabolic capacity of numerous amino acids is seen, while seemingly flavin-dependent processes of the nitrogen assimilation are prioritised. In summary, this thesis contributes to the extended knowledge about the riboflavin biosynthesis pathway as well as to the understanding about consequences of flavin deficiency in plants. Moreover, the first attempt to increase the vitamin B2 content in plants is presented.

Der Karpfen, Cyprinus carpio, ist eine tetraploide Fischart aus der Familie Cyprinidae, die vor 20-50 Mio Jahren entstanden ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war der Versuch, die funktionelle Rolle der duplizierten GH Gene des Karpfens durch das Studium ihrer Struktur, Evolution und Expression zu verstehen. Die Introns des zweiten GH Gens des Karpfens wurden erstmalig sequenziert und Sequenzvergleiche der kodierenden und nicht-kodierenden Bereiche von Allelen beider GH Gene wurden vorgenommen. Eine phylogenetische Analyse wurde durchgefuhrt, um die Beziehungen der GH Gene des Karpfens zu denen des tetraploiden Goldfischs und anderer diploider Cypriniden zu untersuchen. Zusatzlich wurden weitere duplizierte Gene des Karpfens, von denen einige auch fur das Wachstum von Bedeutung sind, phylogenetisch analysiert. Der Test der relativen Evolutionsrate nach Tajima (1993) zeigte einen statistisch signifikanten Anstieg der Evolutionsrate des GH I Gens beim Karpfen. Es wurden in der vorliegenden Arbeit einige weitere duplizierte Genpaare des Karpfens und Goldfischs gefunden, die ebenfalls eine Lockerung funktioneller Zwange oder sogar Beweise fur positive Darwin?sche Selektion bei einem der beiden Duplikate zeigen. Der Expressionstest hat gezeigt, dass die GH I und GH II Gene auf identischen Niveaus bei Karpfenbrut exprimiert werden, wahrend bei ein Jahr alten Karpfen, drei Jahre alten Mannchen und Weibchen sowie den 10 Monate alten, an kalte Temperaturen (2°C) angepassten Fischen die Expression von GH II statistisch signifikant geringer war als die von GH I. Es wurde eine neue und einfache Methode zur Herstellung von rekombinanten, biologisch aktiven GH-Proteinen ohne Notwendigkeit des Refolding entwickelt. Sie ermoglicht spatere Tests, ob die Aktivitat von unterschiedlichen GH-Varianten des Karpfens gleich oder unterschiedlich ist. / The common carp, Cyprinus carpio, is a tetraploid fish species from the family Cyprinidae that arose about 20-50 Myr ago. The aim of the present work was attempting to understand the functional role of the duplicated common carp GH genes by studying their structure, evolution and expression. The introns of the second GH gene of common carp were sequenced for the first time and sequence comparisons of coding and non-coding regions of alleles of both GH genes were carried out. A phylogenetic analysis was done to examine the relationships of common carp GH genes with GH genes of the tetraploid goldfish and other diploid Cyprinids. In addition, phylogenetic analyses were done with other duplicated genes of common carp, some of which also important for growth. The relative rate test of Tajima (1993) showed a statistically significant increase in the evolution rate of the common carp GH I gene. In addition, some other duplicated gene pairs in common carp and goldfish with relaxation of functional constraints or even evidence of positive Darwinian selection in one of the two gene duplicates were found in the present study. The test of expression rates of the two GH genes has shown that the GH I and GH II genes were expressed at similar levels in carp fry. In contrast, the expression of GH II was statistically significantly lower than that of GH I in one year old carp, three years old males and females as well as in 10 months old fish adapted to cold temperature (2°C). To enable testing the hypothesis if activity of GH diverged between different GH variants of common carp a new and simple method for production of recombinant, biologically active GH proteins without the necessity of refolding was developed.