Die Vermehrung des Influenza A Virus umfasst, neben anderen wichtigen Schritten, die Transkrption der viralen mRNA und die ribosomale Translation der viralen Proteine. Mit großem Aufwand wurde bereits an der Entwicklung von Methoden zur Untersuchung des zeitlichen Verlaufs der Synthese viraler mRNA während des Vermehrungszyklusses in der Wirtszelle geforscht. In der vorliegenden Arbeit wurden sequenzspezifische FIT-PNA-Sonden, welche einen einzelnen, als künstliche fluoreszente Nukleobase dienenden Interkalator tragen, auf die quantitative RT-PCR sowie die Lebendzellmikroskopie angewandt. Die FIT-PNA-Sonden bieten dabei eine hohe Sensitivität und eine enorme Zielspezifität unter nichtstringenten Hybridisierungsbedingungen. Im Speziellen wurden FIT-PNA Sonden mit Sequenzspezifität zur mRNA der Neuraminidase und des Matrixproteins 1 entworfen und untersucht. Die somit erhaltenen Ergebnisse besitzen eine hohe biologische Relevanz und weisen diese Sonden als vielversprechende Methodik in der Virologie und der Zellbiologie aus. Ihre Anwendung konnte bereits auf das Vesikular Stomatitis Virus ausgeweitet werden. Die Kombination aus biologischer Expertise mit modernen Proteomstudien und detaillierten statistischen Analysen ermöglichte einen systemumfassenden Blick auf die durch eine Infektion bedingten Auswirkungen auf die Wirtszelle. Die Markierung von Aminosäuren mit stabilen Isotopen in Zellkultur wurde hierfür benutzt. Es wurden Proben zu verschiedene Zeitpunkten im Infektionszyklus in die Untersuchungen einbezogen, um zeitaufgelöste Detailstudien der zellulären Proteinbiosynthese und Degradation durchzuführen. / Replication of the influenza A virus involves, amongst other critical steps, the transcription of viral mRNA and ribosomal translation of viral proteins. Significant efforts have been devoted to the development of methods that allow the investigation of viral mRNA progression during the replication cycle inside the host cell. In the present thesis sequence specific FIT-PNA probes which contain a single intercalator serving as artificial fluorescent nucleobase were introduced for quantitative RT-PCR and live cell imaging. FIT-PNAs provide for both high sensitivity and high target specificity at nonstringent hybridisation conditions (where both matched and mismatched probetarget complexes coexist). In particular, FIT-PNAs specific to the neuraminidase and matrix protein 1 were successfully designed and examined. The obtained results are of high biological importance and suggest the FIT-PNA technique as promising tool in the field of virology and cell biology as this approach was readily applied to Vesicular Stomatitis Virus as well. By combining biological expertise with modern high throughput quantitative proteomics and detailed statistical analysis a system wide view of the effects and dynamics of the early H1N1 infection on the cell proteome was generated. Stable isotope labelling of amino acids in cell culture (SILAC) was employed to globally track changes in gene expression at the protein level. Furthermore, samples at various time points post infection enabling a more detailed timeresolved analysis of host cell protein biosynthesis and degradation during the infection cycle were included. As a result the specific expression characteristics of single genes and functional gene subsets in response to viral infection were bioinformatically analysed.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/17024 |
| Date | 09 September 2011 |
| Creators | Kummer, Susann |
| Contributors | Herrmann, Andreas, Veit, Michael, Klipp, Edda |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf, application/octet-stream, application/octet-stream |
| Rights | Namensnennung - Keine kommerzielle Nutzung, http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/de/ |
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