Der TRPV3 (transient receptor potential vanilloid 3)-Kanal ist ein nicht-selektiver, Kalzium-permeabler Kationenkanal, der hauptsächlich in epidermalen Keratinozyten exprimiert wird (Peier et al., 2002). Eine genaue Regulierung der Kalzium-Dynamik in der Epidermis der Haut spielt bei der Bildung der Hautbarriere eine entscheidende Rolle, wodurch viele Aspekte der Epidermisfunktion, einschließlich der Proliferation, Differenzierung und Migration der Keratinozyten, kontrolliert werden (Bikle & Mauro, 2014; S. E. Lee & Lee, 2018). Bei näherer Betrachtung des Einflusses des TRPV3-Kanals auf die Hauthomöostase deuten aktuelle Studien darauf hin, dass der TRPV3-vermittelte Einstrom von Kalziumionen in Keratinozyten die Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen und Wachstumsfaktoren induziert (Cheng et al., 2010; Xu et al., 2006). Daher kann jedes Ungleichgewicht in der TRPV3-Aktivität drastische Auswirkungen auf die gesunde Funktion der Haut haben, wobei eine Kanalüberaktivität mit Hyperkeratose und Entzündungen der Haut in Verbindung gebracht werden kann. Diese Störungen der Haut sind unter anderem für Hauterkrankungen wie der atopischen Dermatitis und dem schwerwiegenden Olmsted-Syndrom, das durch gain-of-function-Mutationen des TRPV3-Kanals verursacht wird, charakteristisch (Lin et al., 2012; Yamamoto-Kasai et al., 2013). Darüber hinaus kann eine Kanalunterfunktion mit einer beeinträchtigten Hautregeneration und Wundheilung korreliert werden (Aijima et al., 2015; Miyamoto et al., 2011). Diesbezüglich wurde gezeigt, dass der TRPV3-Kanal mit dem Rezeptor für den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF-Rezeptor) einen Signalkomplex bildet, um die Bildung der Hautbarriere zu regulieren, wobei die Aktivität von TRPV3 wahrscheinlich durch die Aktivierung des EGF-Rezeptors verstärkt wird (Cheng et al., 2010).
Der TRPV3-Kanal wird ebenso durch verschiedene natürliche Verbindungen, wie Carvacrol und Thymol, oder durch synthetische Substanzen, wie 2-Aminoethoxy-diphenylborat (2-APB) aktiviert, wobei 2-APB häufig zur Untersuchung der Funktion von TRPV3 in vitro angewendet wird, da es sich hierbei um einen kostengünstigen und relativ potenten TRPV3-Aktivator handelt. 2-APB wirkt jedoch auch auf eine Vielzahl anderer TRP-Kanäle, sodass es schwierig ist, die Effekte, die durch 2-APB in nativen Geweben ausgelöst werden, auf eine Aktivierung des TRPV3-Kanals zurückzuführen (Hinman, Chuang, Bautista, & Julius, 2006; Hu et al., 2004; M. Li, Jiang, & Yue, 2006; Togashi, Inada, & Tominaga, 2008; Vogt-Eisele et al., 2007; Chokshi, Fruasaha, & Kozak, 2012; Lievremont, Bird, & Putney, 2005).
Bei der früheren Durchführung eines Wirkstoffscreenings einer ChemBioNet Substanzbibliothek wurde der TRPV3-selektive Inhibitor 26E01 identifiziert (Bischof et al., 2020). Um weitere potente und spezifische TRPV3-Modulatoren zu identifizieren, wurde eine hausinterne Substanzbibliothek bestehend aus 50 chemischen Verbindungen, die im Labor von Thomas Magauer synthetisiert wurden, und die SelleckChem-Substanzbibliothek L1700 bestehend aus 4718 Verbindungen gescreent. In dieser Arbeit ist die Identifizierung, Validierung und erste Anwendung des neuen, potenten, TRPV3-selektiven Aktivators KS0365 beschrieben. Durch die Anwendung dieses neuartigen TRPV3-Aktivators konnte im Rahmen dieser Studie gezeigt werden, dass TRPV3-Aktivatoren den Reepithalisierungsprozess nach einer Verletzung der Haut fördern könnten. Diese Schlussfolgerung ist auf die in dieser Studie festgestellte Beobachtung zurückzuführen, dass infolge der Aktivierung des TRPV3-Kanals mit KS0365 in den Leading-Edges von Keratinozyten und in migrierenden Keratinozyten, die im Rahmen von Migrationsassays am Rande der erzeugten Lücke lokalisiert waren, die stärksten Anstiege der intrazellulären Kalziumionenkonzentration ausgelöst wurden und KS0365 wahrscheinlich aufgrund dieser Effekte eine Beschleunigung der Keratinozytenmigration bewirkte.:Inhaltsverzeichnis
1. Abkürzungsverzeichnis 1
2. Einleitung 5
2.1 Die Funktion von Kalzium in der Haut 5
2.2 Ionenkanäle in Keratinozyten 8
2.3 Der TRPV3-Kanal 10
3. Zielstellung und Methodenwahl 17
4. Materialien und Methoden 21
4.1 Kultivierung immortalisierter Zelllinien 21
4.2 Isolierung primärer Keratinozyten 22
4.3 Erzeugung einer stabilen m308kTRPV3-YFP-Zelllinie 23
4.4 Interne Totalreflexionsfluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie 24
4.5 Small-interfering RNA (siRNA)-vermittelter Knockdown 24
4.7 Wirkstoffscreening 26
4.8 Hit-Validierung durch Erstellung von Konzentrations-Wirkungsbeziehungen 27
4.9 Selektivitätstestung 27
5.0 Analyse von synergistischen Wirkungen von TRPV3-Aktivatoren 27
5.1 Ratiometrisches Kalzium-Imaging 28
5.2 Elektrophysiologische Untersuchungen 29
5.3 Bestimmung der metabolischen Zellaktivität 29
5.4 Zellmigrations-Assays 30
5.5 Kalzium- Imaging mittels interner Totalreflexionsfluoreszenz-Mikroskopie 30
5.6 Daten-Analyse 31
6. Ergebnisse 33
6.1 Wirkstoffscreening und Bestimmung von Konzentrations-Wirkungsbezie-
hungen 33
6.2 Selektivitätstestung des neuen TRPV3-Aktivators KS0365 38
6.3 Validierung des siRNA-vermittelten TPRV3-Knockdowns 42
6.4 Kalzium-Imaging in primären Keratinozyten 44
6.5 Elektrophysiologische Untersuchungen 45
6.6. Analyse von synergistischen Wirkungen von TRPV3-Aktivatoren 49
6.7 Evaluierung der Langzeit-Tolerabilität von TRPV3-Modulatoren 50
6.8 Zellmigrations-Assays 53
6.9 Kalzium-Imaging in migrierenden Keratinozyten 58
7.0 Analyse von Kalzium-Signalen in der Leading-Edge von Keratinozyten mittels TIRF-Mikroskopie 60
8. Diskussion und Ausblick 63
9. Zusammenfassung der Arbeit 75
10. Referenzen 79
11. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 95
12. Lebenslauf 96
13. Publikationen 96
14. Wissenschaftliche Poster und Vorträge 96
15. Danksagung 97
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:85514 |
| Date | 24 May 2023 |
| Creators | Maier, Marion |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/updatedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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