Metastasis Associated in Colon Cancer 1 (MACC1) ist ein prognostischer und prädiktiver Biomarker für Tumorprogression und Fernmetastasierung von Darmkrebs. Der exponentielle Anstieg der MACC1-verbundenen Publikationen seit dessen Entdeckung im Jahr 2009 verdeutlicht Mitwirkung von MACC1 am Krankheitsfortschritt vieler solider Tumore. Dies umfasst sich nicht nur die erhöhte Tumorinvasion und Metastasierung, sondern ebenso erhöhte Tumorangiogenese, dessen Stammzellfähigkeit und die Vermeidung von Apoptose. Obwohl unsere Forschungsarbeiten in den letzten Jahren neue Erkenntnisse über die Auswirkung von MACC1 in der Tumorprogression brachten, ist über dessen Proteinstruktur und der damit verbundenen Funktion in physiologischen Prozessen wenig bekannt.
In dieser Arbeit wird zum ersten Mal die Rolle von MACC1 in der Clathrin-abhängigen Endozytose (CME) untersucht. Nach massenspektrometrischer Analyse des MACC1-Interaktoms wurde die Proteinbindung von MACC1 und den CME-verbundenen Faktoren CLTC, DNM2 und AP-2α, bzw. dem CME-Cargo TfR experimentell bestätigt. Davon ausgehend wurde der Endozytoseweg von TfR und MACC1-abhängige Änderungen in dessen Oberflächenverteilung, Internalisierung, Recycling und Proteinabbau mittels neu etablierter Methoden untersucht und ergab einen deutlichen Einfluss von MACC1 auf die Internalisierung und das Recycling von TfR. Daraufhin wurden durch Sequenzanalyse der MACC1-Proteinstruktur vorhergesagte N-terminale Interaktionsbereiche mit CME-Faktoren betrachtet, die eine Clathrin-Box sowie NPF- bzw. DPF-Motive umfassen. Deletionsvarianten von MACC1 wurden zunächst auf ihre Interaktionsfähigkeit mit CLTC, DNM2 und TfR getestet, deren subzelluläre Lokalisation bestimmt, sowie deren Einfluss auf den Endozytoseweg von TfR geprüft.
Das erhöhte Recycling von TfR in Abhängigkeit von MACC1 wurde für EGFR als wichtigen Vertreter von krebsrelevanten Rezeptor-Tyrosinkinasen überprüft. Die Analyse des TfR-EGFR gekoppelten frühen Endozytosewegs ergab eine erhöhte Recyclingrate des Rezeptors in verschiedenen MACC1-überexprimierenden Zelllinien. Um den Einfluss der N-terminalen Interaktionsbereiche von MACC1 auf den Endozytoseweg von EGFR zu verstehen, wurden die MACC1-Deletionsvarianten nicht nur auf Änderungen im Verlauf der EGFR-Endozytose geprüft, sondern ebenfalls auf die Aktivierung des Rezeptors sowie nachgelagerter Signaltransduktoren wie PI3K/AKT und ERK1/2. Die Wichtigkeit der Interaktionsbereiche von MACC1 wurde durch eine Analyse der EGF-induzierten Zellproliferation bestätigt.
Die Ergebnisse dieser Arbeit, die die Rolle von MACC1 in der Endozytose beschreiben, erweitern die Interventionsmöglichkeiten gegenüber der Fernmetastasierung solider Tumore und könnten helfen, das Überleben betroffener Patienten zu verlängern. / Metastasis Associated in Colon Cancer 1 (MACC1) is a newly discovered prognostic and predictive biomarker associated with tumor progression and metastasis development. Since our first report concerning MACC1 in 2009, MACC1-related research has been exponentially increasing. At present, MACC1 involvement in the progression of many cancer types has become increasingly clear. MACC1 does not only promote invasion and metastasis formation, but it also induces angiogenesis, stemness and prevents apoptosis. Although in the last years our research concerning MACC1 gained new insights into cancer progression, little is known about its structural role and functions in physiological processes.
In this thesis, I will address for the first time the role of MACC1 during CME (clathrin-mediated endocytosis). Importantly, MACC1’s role in CME was first suggested by interactome analysis. Thus, MACC1’s CME interactors (CLTC, DNM2, AP2α and TfR), were first identified and validated. In addition, MACC1’s impact on TfR endocytic traffic was addressed by studying its effect on surface distribution, uptake, recycling and degradation of the receptor with pioneering and newly established methods. As a result of this research, MACC1 shows a clear impact on TfR internalization and recycling. Thus, the present work dissects the MACC1 protein structure containing predicted CME domains such as clathrin box, NPFs and DPF. By deleting these domains, first the impact on the binding between MACC1 and CLTC, DNM2 and TfR were analyzed. Also, we characterized the distribution of MACC1 in the cell depending on the presence of its CME domains, and then I addressed their specific impact during TfR endocytic traffic.
After we elucidated the MACC1-dependent increase in TfR recycling, we compared its newly discovered function during EGFR endocytic traffic. By analyzing TfR -EGFR coupled early endocytic traffic during EGF-stimulated internalization in MACC1 overexpressing cell lines, we discovered that MACC1 promotes faster recycling of EGFR to PM, in two different cell lines. In order to understand the MACC1 CME domains impact on EGFR endocytic traffic, we dissected not only EGFR endocytic fate in MACC1 CME mutant cell lines but also the impact on EGFR trans-activation after EGF-stimulated internalization and downstream signaling, in particular, AKT and ERK1/2. To conclude with functional analysis, we also addressed MACC1 CME domains impact on cell proliferation revealing that CME domains integrity is important for efficient cell proliferation.
The present work sheds new light on MACC1’s role during endocytosis, opening a possibility of intervention on metastasis development in CRC to improve the survival of patients.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/21758 |
| Date | 03 January 2020 |
| Creators | Imbastari, Francesca |
| Contributors | Stein, Ulrike, Herrmann, Andreas, Lange, Adam |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | (CC BY-NC 3.0 DE) Namensnennung - Nicht kommerziell 3.0 Deutschland, http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/de/ |
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