O destaque da cana-de-açúcar como fonte de energia renovável tem motivado a busca por melhorias no processo de cultivo e processamento da planta, buscando o aumento da produtividade dos canaviais. Dentre os fatores limitantes para o aumento da produção de cana-de-açúcar, destaca-se a ocorrência de fitodoenças, como por exemplo a escaldadura das folhas, causada pela bactéria Xanthomonas albilineans. Essa doença causa a diminuição do valor energético do caldo extraído da planta, e a ausência de tratamento químico ou biológico acarreta na necessidade de reforma precoce dos canaviais, causando perdas significativas para o agronegócio brasileiro. Portanto, existe uma grande necessidade no desenvolvimento de novas moléculas capazes de atuar como defensivos agrícolas com eficiência e especificidade. Neste trabalho, duas estratégias foram empregadas para a identificação de moléculas como potenciais candidatos a agroquímicos. Na primeira, avaliou-se o potencial inibidor de moléculas de origem natural ou sintética em ensaios fenotípicos contra a cultura de X. albilineans, identificando dois derivados, um de nitrotiofeno e um de nitrofurano, capazes de inibir o crescimento bacteriano. Na segunda estratégia, duas enzimas da via de biossíntese de folatos, 2-amino-4-hidroxi-6-hidroximetil di-hidropterina pirofosfoquinase (XaHPPK) e 7,8-di-hidroneopterina aldolase (XaDHNA), foram selecionadas como alvos moleculares. Métodos em biologia molecular e biologia estrutural foram empregados para a obtenção de proteínas puras e solúveis, visando-se a elucidação das estruturas tridimensionais e caracterização bioquímica dos alvos. Estudos de desnaturação térmica foram conduzidos para determinação da afinidade da XaHPPK pelo substrato natural 7,8-di-hidropterina (Kd = 97 ± 3 µM). Os experimentos de biologia estrutural resultaram na determinação da estrutura da XaHPPK a 2,3 Å de resolução (PDB ID, 5VSP) com o grupo espacial P212121. A obtenção da estrutura a alta resolução permitiu a aplicação de estratégias computacionais para a descoberta de potenciais inibidores. Os estudos da XaDHNA possibilitaram a coleta de um conjunto de dados à 3,5 Å de resolução, no grupo espacial I422. Os experimentos e resultados obtidos neste doutorado ampliam o conhecimento sobre a via de biossíntese de folatos em X. albilineans e abrem o caminho para a descoberta de novos inibidores antibacterianos utilizando técnicas baseadas na estrutura do alvo. / The importance of sugarcane as a source of renewable energy has pushed researchers to search for improvements in the process of cultivation and processing of the plant, looking after increase the productivity of sugarcane crops. Among known facts that limits sugarcane production, we highlight the occurrence of plant diseases, such as leaf scald, a bacterial disease caused by Xanthomonas albilineans. This disease decreases the energetic value of the broth extracted from the cane, and the absence of chemical or biological treatment entails the need for early refresh sugarcane plantations, causing significant losses for Brazilian agribusiness. Therefore, the economic interest in the development of new molecules capable of acting as agricultural defenses with efficiency and specificity is motivating. Acting on the essential biochemical pathways of the pathogen is a recurring strategy in the development of bioactive molecules. Thus, several inhibitor identification strategies were used. Firstly, the inhibitory potential of molecules from natural or synthetic origins were evaluated in phenotypic assays against the culture of X. albilineans, identifying two nitrothiophene and nitrofuran derivatives capable of inhibiting bacterial growth at 2 mM. In another strategy, the essential pathway of X. albilineans for folate biosynthesis was selected and two proteins of this pathway investigated: 2-amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl dihydropteridine pyrophosphokinase (XaHPPK) and 7,8-dihydroneopterin aldolase (XaDHNA). Both molecular biology and structural biology methods were used to obtain pure and soluble proteins, aiming the obtaining of three-dimensional structures and biochemical characterization of targets. Studies with the XaHPPK protein for kinetic characterization made possible to calculate the Kd apparent (Kd = 97 ± 3 μM) for the substrate 7,8-dihydropterin. Structural biology experiments resulted in a 2.3 Å resolution structure in the space group P212121, available in the PDB under the 5VSP identifier. Structure based drug design for XaHPPK structure, SBDD, were performed using ZINC15 database with hierarchical filters and the Glide docking software. The XaDHNA studies enabled the collection of a set of data at 3.5 Å resolution in the space group I422. The experiments and results obtained in this doctorate increase the knowledge about the folate biosynthesis pathway in X. albilineans and open the way for the discovery of new antibacterial inhibitors using structure based drug design.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-31012018-164124 |
| Date | 22 September 2017 |
| Creators | Lima, Gustavo Machado Alvares de |
| Contributors | Guido, Rafael Victório Carvalho |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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