Microrganismos geneticamente modificados (OGMs), obtidos através das técnicas de biologia molecular são amplamente utilizados para as mais diversas finalidades, atingindo o ambiente, solo, águas, animais e até mesmo o Homem. Contudo, o comportamento e o destino destes microrganismos no ambiente, depois que sua função tenha sido completada, e onde estes não podem ser controlados, tem sido objeto de preocupação. Para diminuir os riscos potenciais associados à liberação (acidental ou intencional) dos OGMs no ambiente pesquisadores desenvolveram sistemas de contenção de microrganismos geneticamente engenheirados, baseados na clonagem de genes que codificam proteínas tóxicas, sob regulação de promotores indutíveis (para revisão ver Molin et aI., 1993). Estes sistemas permitem o controle da morte celular em tempo pré-determinado, com a indução do promotor que regula o gene que codifica a proteína tóxica. Contudo, embora as leveduras sejam tão importantes e úteis quanto as bactérias, não existem sistemas suicidas usados para contenção destes microrganismos. No presente trabalho, construímos um sistema suicida para a levedura Saccharomyces cerevisiae o qual apresenta o gene da nuclease de Serratia marcescens clonado sob controle do promotor ADH2GAPDH, que é reprimido por glicose. Desde que a nuclease é capaz de destruir DNA e RNA, tal sistema não permitirá que o material genético do OGM em questão, seja transferido para outros microrganismos, após a morte celular. A atividade da nuclease foi detectada in vivo, através da diminuição da viabilidade dos transformantes de levedura, após o consumo da glicose. Quando leveduras mutantes rad52 foram usadas como células hospedeiras, o efeito letal do plasmídeo foi dramaticamente aumentado. Por outro lado, a atividade da nuclease produzida nos tranformantes de levedura foi analisada in vitro, através da incubação de extratos celulares com DNA plasmidiano mostrando a completa degradação deste em gel de agarose. Além disso, em ensaio de microcosmos, a viabilidade das leveduras portadoras do plasmídeo suicida no ambiente diminuiu drasticamente quando comparada com células controles. Estes resultados mostram que a nuclease de Serratía marcescens é expressa de forma ativa em S. cerevísíae sendo capaz de evitar a permanência dos transformantes de leveduras no ambiente, em laboratório, ou em condições simulando o ambiente, sem a necessidade de um indutor adicional. / Genetic Engineered Microorganisms (GEMs), obtained by molecular biology techniques, are becoming of widespread use for different purposes thus reaching the environment, including soil, water, plants, animais and Man. However, the behavior and fate of these microorganisms after their function has been completed in environments where they cannot be physically contained is a matter of concern. To minimize the potential risks associated with the release (deliberate or accidental) of GEMs in the environment, researchers have developed biological containment systems for bacteria which are based on the cloning of genes coding for toxic proteins, under the regulation of regulatable promoters (for review, see Molin et al., 1993). Such suicide systems allow the predetermined control of cell death from the moment the promoter of the killer gene is switched on. However, even if yeasts are as useful and important in biotechnological processes as bacteria, there is no suicide system described so far for the containment of these microorganisms. In the present work, we constructed a suicide system for the yeast Saccharomyces cerevisiae, consisting of the Serratia marcescens nuclease gene, cloned under the control of the yeast AOH2GAPOH promoter, which is repressed by glucose. Since this nuclease is able to destroy DNA and RNA, such suicide system does not allow the genetic material of the GEM to be transferred to other microorganisms upon cell death. The nuclease activity in S. cerevisiae was detected in vivo, through the decrease in cell viability of the yeast transformants, upon glucose consumption. When yeast rad52 mutants were used as the host cells, the lethal effect of the suicide plasmid was dramatically increased. On the other hand, the activity of the nuclease produced in yeast transformants was analyzed in vitro, by incubation of cell-free extracts with plasmid DNA, showing complete degradation on agarose gels. Furthermore, in microcosmos assays, the viability of the yeast cells carrying the suicide plasmid decreased drastically when compared to control cells. These results showed that the S. marcescens nuclease is expressed in an active form in S. cerevisiae, being able to avoid the maintenance of the yeast transformants, either in the laboratory, or in conditions simulating the environment, without the need of adding any inducer.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-20012014-164533 |
| Date | 09 April 1999 |
| Creators | Fernandes, Andrea Balan |
| Contributors | Schenberg, Ana Clara Guerrini |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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