Diese Arbeit beschäftigt sich mit zwei Aspekten der serologischen Forschung am Zika-Virus (ZIKV). Im ersten Teil wurden ZIKV NS1 und ZIKV Equad in ihrer Eignung als Antigene für serologische Assays zur spezifischen Detektion der ZIKV Infektion in Abgrenzung zu Infektionen mit anderen Flaviviren untersucht. Der zweite Teil vergleicht zwei Methoden zur Expression von ZIKV NS1: Drosophila S2 Zellen und in E. coli Bakterien.
ZIKV zog 2014-2016 bei einem Ausbruch in Brasilien große Aufmerksamkeit auf sich, da Zusammenhänge mit einerseits gehäuft auftretenden Mikrozephaliefällen bei Infektionen in der Schwangerschaft und andererseits schweren neurologischen Komplikationen wie dem Guillain-Barré-Syndrom hergestellt wurden. ZIKV ko-zirkuliert mit anderen Flaviviren wie dem West-Nil Virus (WNV) und dem Dengue Virus (DENV). Da viele Infektionen mit Flaviviren asymptomatisch verlaufen oder nur mit unspezifischen Symptomen einhergehen, ist eine sichere labordiagnostische Unterscheidung von hoher Relevanz. Die Flavivirus-Diagnostik basiert dabei hauptsächlich auf zwei Methoden: dem direkten Virusnachweis aus Blut oder Urin (bis zu 14 Tage nach Symptomauftritt möglich) mithilfe von PCR und dem serologischen Nachweis von Antikörpern. Hohe strukturelle Ähnlichkeiten zwischen verschiedenen Flaviviren wie ZIKV und DENV, welche zum Auftreten kreuzreaktiver Antikörper führen, sorgen dafür, dass die spezifische Serologie bisher eine Herausforderung darstellt. Ein häufig verwendetes Antigen in der serologischen Flavivirus-Diagnostik ist das Envelope-Protein (E-Protein). Dieses ist bei der ZIKV-Diagnostik aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit mit den E-Proteinen anderer Flaviviren Ziel kreuzreaktiver Antikörper. Besonders eine Struktur, die Fusion-Loop Sequenz, ist hoch konserviert. Das Auftreten kreuzreaktiver Antikörper erschwert eine spezifische Diagnostik. Um die mangelhafte Spezifität der serologischen Tests zu verbessern, wurden zwei Antigene entwickelt. Ein Antigen basiert auf dem Nicht-Struktur-Protein 1 (NS1), ein anderes auf einer E-Protein-Mutante mit vier Aminosäureninsertionen in der Fusion-Loop-Sequenz. ZIKV NS1 zeigte bisher in zwei Studien durch Huzly et al. (2016) und Steinhagen et al. (2016) eine hohe Spezifität. Das modifizierte E-Protein konnte bereits bei WNV und DENV die serologische Spezifität verbessern. Diese beiden Antigene wurden in der vorliegenden Arbeit mit einem Panel aus Seren von Infektionen mit ZIKV, DENV, WNV und Tick-borne encephalitis Virus (TBEV) getestet. Als Referenzgruppe diente eine Reihe Flavivirus-negativer Seren.
Nach Klonierung, Synthese und Aufreinigung des NS1 Proteins wurde dieses sowie das ZIKV Equad mit den Seren in IgM und IgG Assays getestet. Aus den Ergebnissen dieser Tests wurden für beide Proteine Sensitivität und Spezifität ermittelt, anschließend wurden beide Antigene verglichen.
Die Ergebnisse zeigen, dass ZIKV NS1 statistisch signifikant im IgM- und IgG-Assay zwischen ZIKV und anderen Flavivirus-positiven Seren unterscheiden kann (p<0,05). Diese Unterscheidung war bei ZIKV Equad im IgG Assay zwischen ZIKV- und DENV-positiven Seren statistisch signifikant. Nach Ermittlung eines ROC-Cut-Offs war ZIKV Equad dem ZIKV NS1 in Hinblick auf Sensitivität (IgM: NS1 100%, Equad 86%; IgG: NS1, Equad 100%) und Spezifität (IgM: NS1 90%, Equad 85%; IgG: NS1 97% Equad 73%) jedoch unterlegen.
Die Spezifität von ZIKV NS1 zu DENV positiven Seren ist mit 89% bereits gut. Dennoch zeigt sich anhand der hohen Signale zweier DENV positiver Seren, dass auch ZIKV NS1 Ziel kreuzreaktiver Antikörper ist. Diese Beobachtung wird durch die Studien von Chang et al. (2017) und Freire et al. (2017) bestärkt, welche ZIKV NS1 mit bioinformatischen Methoden untersuchten und so durch Vergleich mit DENV NS1 auf das Vorhandensein kreuzreaktiver Epitope schlossen.
Für ZIKV Equad konnte von Rockstroh et al. (2018) durch einen Kompetitionsassay mit DENV Equad eine deutliche Verbesserung der Spezifität erreicht werden, die eine nahezu sichere Abgrenzung zu DENV ermöglicht. Daraus folgend könnte ein analog durchgeführter Kompetitionsassay mit ZIKV und DENV NS1 ebenfalls eine Verbesserung der Spezifität bringen.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden zwei Verfahren zur Synthese des ZIKV NS1 Proteins verglichen. Das im ersten Teil verwendete Protein wurde in Drosophila S2 Zellkulturen hergestellt. Eine sehr weit verbreitete Methode stellt die Synthese in E. coli Bakterien dar. Diese hat den Vorteil, dass mit wenig Aufwand, kostengünstig und in kurzen Zeitabschnitten eine große Proteinmenge synthetisiert werden kann. Sie hat im Vergleich zu eukaryontischen Zellkulturen wie der S2 Zelllinie den Nachteil, dass E.coli das Protein nicht in löslicher, sondern hauptsächlich in aggregierter Form produziert. Das Protein sammelt sich im Zellinneren an. Da das Protein bei der Extraktion denaturiert werden muss, ist im Anschluss eine Rückfaltung notwendig, um es in die korrekte Konformation zu überführen.
Die richtige Faltung der Proteine ist in der serologischen Diagnostik besonders wichtig, da viele Antikörper strukturelle Epitope erkennen. Ziel dieser Arbeit war es daher, einen Vergleich und eine Bewertung der beiden unterschiedlich hergestellten Proteine in Hinblick auf Sensitivität und Spezifität mit einem Panel an ZIKV- und DENV-positiven Seren sowie negativen Seren durchzuführen. Daraus lässt sich ableiten, ob eine Proteinsynthese in E. coli äquivalente Sensitivtäten und Spezifitäten ergeben.
Die Ergebnisse zeigen, dass grundsätzlich auch mit dem E. coli synthetisierten NS1 Protein eine spezifische und sensitive ZIKV Diagnostik möglich ist. Die Spezifität in Abgrenzung zu DENV-positiven Seren war allerdings niedriger als bei ZIKV NS1, welches in Insektenzellen synthetisiert wurde. Außerdem ließ sich eine stärkere Hintergrundbindung der negativen Seren messen. Möglicherweise lässt sich dies aber durch eine weitere Aufreinigung durch Größenausschlusschromatographie verringern. Zusammengefasst ergibt sich, dass die ZIKV NS1 Synthese in Drosophila S2 Zellen im Hinblick auf die Spezifität der Synthese in E. coli überlegen ist. Aufgrund der geringen Anzahl untersuchter Seren ist die Beobachtung aber statistisch nicht signifikant und sollte mit einem größeren Serumpanel auch unter Einbeziehung von Seren mit Infektionen durch andere Flaviviren verifiziert werden.:1. Abkürzungsverzeichnis 5
2. Einleitung 7
2.1 Klinik & Historie 7
2.2 Epidemiologie der Flaviviren 8
2.3 Transmission 9
2.4 Struktur 9
2.5 Serologische Immunreaktion 11
2.6 Diagnostik 13
Direkter Virusnachweis 13
Serologischer Nachweis 13
2.7 Expression rekombinanter Proteine 14
3. Fragestellung 15
4. Material 17
4.1 Allgemeine Materialien: 17
4.2 Zellkulturmaterialen 17
4.3 Chemikalien 18
4.4 Kits 18
4.5 Puffer 19
4.6 Molekularbiologische Materialien 19
4.7 Antikörper 19
4.8 Geräte 20
4.9 DNA Sequenzen der Proteine 20
4.10 Primer 21
4.11 Verwendete Vektoren 21
4.12 Patient*innenproben 22
5. Methoden 23
5.1 Molekularbiologische Methoden 23
Klonierung 23
Transformation 26
Transfektion Drosophila S2 Zellen durch Calcium-Phosphat-Präzipitation 26
Analyse- und Messmethoden Molekularbiologie 28
Extraktions- und Reinigungsmethoden Molekularbiologie 28
5.2 Mikrobiologische Methoden 28
Bakterienkultivierung 28
Insektenzell-Kultivierung 28
Proteinexpression in Bakterienzellen 29
Proteinexpression in Insektenzellen 29
5.3 Proteinbiochemische Methoden 30
Aufreinigung der Insektenzell-exprimierten Proteine 30
Aufreinigung des E. coli-exprimierten ZIKV NS1 31
Proteinrückfaltung 32
Bicinchoninic Acid (BCA) Assay 32
Bradford Assay 33
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 34
Western Blot 36
5.4 Immunologische Methoden 37
Antikörperfärbung des Western Blots 37
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 37
5.5 Statistische Methoden 38
Mann-Whitney-Test 38
Bestimmung der Cut-Off Werte mithilfe einer Receiver-Operating Curve 39
Ermittlung von Sensitivität und Spezifität 39
6. Ergebnisse 40
6.1 Vergleich ZIKV Equad und ZIKV NS1 40
Insektenzell-Expression von ZIKV NS1 40
IgM Assays 48
IgG Assays 54
6.2 Vergleich der Expression von ZIKV NS1 in Insektenzellen und in E. coli 59
ZIKV NS1 Expression in E. coli 59
Vergleich der Rückfaltung des NS1 Protein vor und nach PBS Dialyse 64
Vergleich der NS1 Expression durch SDS PAGE 66
Vergleichender ELISA der ZIKV NS1 Insektenzell-Expression mit der E. coli-Expression 67
7. Diskussion 69
7.1 Vergleich ZIKV NS1 und ZIKV Equad 69
Ausblick 73
7.2 Vergleich der ZIKV NS1 Expressionsmethoden 73
Ausblick 74
8. Zusammenfassung der Arbeit 75
9. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 78
10. Danksagung 79
11. Abbildungsverzeichnis 80
12. Tabellenverzeichnis 81
13. Quellenverzeichnis 82
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:79088 |
| Date | 09 May 2022 |
| Creators | von Daak, Frederik |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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