Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Actinobacillus pleuropneumoniae est un pathogène strict des voies respiratoires du porc et l'agent causal d'une pleuropneumonie. Plusieurs facteurs de virulence déjà connus sont impliqués dans ce processus infectieux. Récemment, nous avons démontré la liaison de l'hémoglobine porcine au lipopolysaccharide (LPS) d'A. pleuropneumoniae. Nous avons également mis en évidence qu'A. pleuropneumoniae pouvait utiliser l'hémoglobine comme seule source de fer pour sa croissance. Par contre, aucune information n'est présentement disponible concernant le système d'acquisition en fer provenant de l'hémoglobine porcine. Certains chercheurs ont identifié la liaison entre le LPS de certaines bactéries et l'hémoglobine humaine. De plus, des protéines liant l'hémoglobine ont été mises en évidence chez certaines bactéries. L'intérêt premier des études décrites dans cette thèse était de caractériser les molécules impliquées dans la liaison de l'hémoglobine porcine chez A. pleuropneumoniae. Le premier objectif de ce travail consistait à étudier l'effet de la liaison de l'hémoglobine porcine sur les propriétés biologiques et physiques du LPS d'A . pleuropneumoniae. Tout d'abord, la liaison de l'hémoglobine porcine à la surface de la cellule entière d'A. pleuropneumoniae a été mise en évidence par microscopie électronique à transmission (MET) et par spectroscopie. Puis il a été observé par cytométrie en flux que cette liaison ne modifiait pas l'accessibilité des anticorps aux antigènes de surface 0 et K. Ensuite, la liaison de l'hémoglobine porcine au lipide A de la molécule de LPS a été confirmée par le déplacement de la sonde fluorescente dansylcadavérine. Des analyses en MET ont mis en évidence que l'hémoglobine porcine fragmentait le LPS et diminuait ainsi sa vélocité de sédimentation sur un gradient de sucrose. Des tests sur lysats d'amébocytes du Limulus (ou LAL) ont révélé que l'hémoglobine diminuait l'activité biologique du LPS et réduisait également son habileté à stimuler la production d'oxide nitrique par les macrophages murins. Le deuxième objectif de notre étude consistait à élaborer une méthodologie nous permettant de quantifier la liaison de l'hémoglobine porcine à la surface d'A. pleuropneumoniae dans le but de comparer différentes souches et différentes conditions de croissance. L'activité liant l'hémoglobine a été évaluée chez A. pleuropneumoniae par cytométrie en flux à l'aide d'hémoglobine porcine marquée à la fluorescéine. L'activité liant l'hémoglobine a été démontrée chez des souches représentatives d'A . pleuropneumoniae appartenant aux sérotypes 1 et 2. En comparant l'activité liant l'hémoglobine chez A. pleuropneumoniae sérotype 1 souche 4074 dans différentes conditions de croissance, il a été démontré que la restriction en fer augmentait l'expression des récepteurs d'hémoglobine. Ceci implique que l'activité liant l'hémoglobine semble, en partie, répressible par le fer. Ces résultats nous indiquaient que, en plus des LPS, des protéines de la membrane externe (OMPs) régulées par le fer pourraient possiblement être impliquées dans l'activité liant l'hémoglobine. De plus, des mutants isogéniques LPS et un mutant acapsulé d A. pleuropneumoniae serotype 1 ont été testés par cytométrie en flux afin de comprendre le rôle des polysaccharides de surface dans l'activité liant l'hémoglobine. Les expériences menées avec le mutant acapsulé ont indiqué que les molécules de surface possédant une activité liant l'hémoglobine étaient plus exposées à la surface cellulaire en absence du polysaccharide capsulaire. Cependant, l'activité liant l'hémoglobine des mutants LPS analysés dans cette étude était semblable à celle de la souche mère. Le profil des protéines de la membrane externe d'A. pleuropneumoniae sérotype 1 obtenu dans des conditions suffisantes ou restreintes en fer a été également évalué sur gel de polyacrylamide. Des OMPs régulées par le fer ont été observées suggérant qu'une ou plusieurs de ces OMPs pourraient jouer un rôle dans l'activité liant l'hémoglobine détectée par cytométrie en flux. Le troisième objectif de notre étude était d'identifier et de caractériser un ou des récepteurs protéiques impliqués dans la liaison de l'hémoglobine porcine. Les souches de référence représentant les 12 sérotypes d'A. pleuropneumoniae ont été examinées pour tester leur habileté à utiliser différentes sources de fer pour leur croissance. Dans un test de promotion, toutes les souches ont utilisé soit l'hémoglobine porcine ou l'hémine porcine. Cette acquisition ne semblait pas spécifique d'espèce étant donné que les souches d'A. pleuropneumoniae ont également utilisé l'hémoglobine bovine ou l'hémine bovine comme seule source de fer pour croître. En utilisant une procédure de purification par affinité à l'aide d'hémine- ou d'hémoglobine-agarose, une OMP majeure de 75 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine a été isolée chez A. pleuropneumoniae sérotype 1 souche 4074 après croissance dans des conditions de restriction en fer. Des OMPs mineures de 47 et 36 kDa liant l'hémine ou l'hémoglobine ont également été identifiées. Une étude portant sur les souches de référence des 12 sérotypes d'A. pleuropneumoniae après croissance dans des conditions de restriction en fer a révélé que toutes les souches, excepté celles des sérotypes 3, 6, 7, et 10 synthétisaient l'OMP majeure de 75 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine. Cette étude a également démontré que l'OMP mineure de 47 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine était conservée chez toutes les souches testées représentant les 12 sérotypes; l'OMP mineure de 36 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine a été isolée chez toutes les souches testées sauf chez la souche 8329/85 représentant le sérotype 12. Le marquage de la cellule entière d'A. pleuropneumoniae au palmitate radioactif a indiqué que l'OMP majeure de 75 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine n'était pas de nature lipoprotéique. Cependant, les OMPs mineures de 47 et 36 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine pourraient être des lipoprotéines étant donné que des bandes d'approximativement 47 et 36 kDa ont été observées suite au marquage. Malgré plusieurs essais, il n'a pas été possible de déterminer la séquence N-terminale en acides aminés de l'OMP majeure de 75 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine. Afin de prouver que l'OMP majeure de 75 kDa purifiée par hémine-agarose ou hémoglobine-agarose étaient identiques et dans le but d'obtenir une séquence nous permettant de synthétiser un oligonucléotide, ces protéines ont été analysées par un spectromètre de masse couplé à un HPLC et à un séquenceur Edman. Ces analyses ont révélé des peptides communs entre l'OMP purifiée par hémineagarose et l'OMP purifiée par hémoglobine-agarose. Ces résultats suggèrent fortement que ces peptides proviendraient de la même protéine. L'ensemble de nos résultats suggèrent donc que l'OMP majeure de 75 kDa et les OMPs mineures de 36 et 47 kDa liant l'hémine et l'hémoglobine chez A. pleuropneumoniae pourraient être impliquées dans le système d'acquisition en fer provenant de l'hémine ou de l'hémoglobine porcine.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/33261 |
| Date | 06 1900 |
| Creators | Archambault, Marie |
| Contributors | Jacques, Mario |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | fra |
| Detected Language | French |
| Type | thesis, thèse |
| Format | application/pdf |
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