Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización en bioquímica clínica y
Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / La neurotransmisión noradrenérgica está relacionada con procesos como el
aprendizaje y la memoria. Se ha observado en el cuadro depresivo una disminución en
la neurotransmisión de noradrenalina (NA), alteraciones de la arquitectura dendrítica y
la disminución de los niveles de factores tróficos como el factor neurotrófico derivado
del cerebro (BDNF). El hecho de que una variación de los niveles de NA pueda activar
diferentes receptores adrenérgicos en el espacio sináptico, podría explicar en parte los
mecanismos de plasticidad sináptica involucrados en cambios morfofuncionales, desde
acciones sobre la complejidad dendrítica hasta la modulación sobre procesos
complejos como aprendizaje y memoria. Esta noción es apoyada por el hecho de que
los fármacos que incrementan los niveles de NA en el espacio sináptico revierten la
atrofia dendrítica observada en modelos animales de depresión, y recuperan el
deterioro cognitivo. En base a estos antecedentes hemos propuesto en esta Tesis que:
“La activación de receptores β‐adrenérgicos promueve un aumento en la complejidad
dendrítica en cultivos primarios de neuronas hipocampales”. Se obtuvieron cultivos
hipocampales de ratas en estado fetal de 18 días (E18), y se cultivaron durante 7 días in
vitro (7 DIV). En estos cultivos se evaluó a través de Western Blot la respuesta frente a
la estimulación de receptores β‐adrenérgicos, midiendo la fosforilación de la Proteína
de Unión al Elemento de Respuesta al AMP cíclico (CREB) frente a estímulos cortos (5‐
15 minutos) con noradrenalina (100 nM) en ausencia y presencia del β‐antagonista
propranolol (10 μM). Junto con ello, se observó la distribución de CREB fosforilado a
través de inmunocitoquímica luego de estímulos de 2 horas con los mismos fármacos.
No fue posible a través de estas técnicas observar modificaciones en la intensidad de la
señal o la distribución de p‐CREB. Sin embargo, la adición de NA fue capaz de promover
un incremento en el calcio citosólico, como se demostró a través del uso de sondas
fluorescentes, y una reducción en la actividad neuronal evaluada por registros whole-cell. Los cultivos a los 7 DIV presentan receptores β2‐adrenérgicos, visualizados a través
de Western Blot. Más aún, estudios de inmunocitoquímica muestran que el receptor β2
presenta una distribución principalmente somatodendrítica. A través de la estimulación
farmacológica de los cultivos durante 24 horas con NA 100 nM o clenbuterol 25 nM, en
ausencia y presencia de propranolol 10 μM, se estudió si la activación de receptores
adrenérgicos modula la morfología dendrítica. Ésta fue evaluada a través de la
medición de puntos de intersección (Análisis de Sholl), puntos de ramificación, largo y
número de dendritas. La estimulación con clenbuterol 25 nM no produjo efecto sobre
ninguno de estos parámetros, descartando la participación de los receptores β2‐
adrenérgicos en la arquitectura dendrítica. Tampoco produjo efectos en la morfología
de las dendritas la administración por separado de noradrenalina o propranolol. Sin
embargo, los cultivos estimulados con NA posterior a la incubación con propranolol
mostraron una reducción en el número de intersecciones del análisis de Sholl en el
rango de los 30‐80 μm en comparación con el control. Estos cambios están
acompañados por un descenso en el largo total de las dendritas primarias, y en
particular de las dendritas primarias mayores a 40 μm, sin que el número de dendritas
primarias por neurona se viera modificado. Un efecto similar se observó en las
dendritas secundarias. Estos resultados sugieren que los cambios en el largo dendrítico
observados probablemente no se asocian a la activación de receptores β2‐adrenérgicos.
Proponemos que la activación de receptores α‐ y β1‐adrenérgicos regularían la
morfología neuronal, probablemente con efectos opuestos, controlando el largo
dendrítico de las dendritas primarias y secundarias de mayor tamaño.
El estudio realizado en esta Tesis por primera vez describe efectos de la activación de
receptores adrenérgicos sobre la morfología neuronal, pudiendo explicar en parte los
cambios morfológicos y mejoría cognitiva tras el tratamiento de fármacos que
incrementan los niveles de NA en el espacio sináptico / Noradrenergic neurotransmission is related with processes as learning and memory. In
depressive behavior, it has been observed a decrease in noradrenaline (NA)
neurotransmission, alterations on dendritic arborization and a decrease in levels of
trophic factors, such as brain derived neurotrophic factor (BDNF). The fact that
different levels of NA can activate different adrenergic receptors at synaptic cleft, could
explain part of synaptic neuroplasticity mechanisms involved in morphofunctional
alterations, from actions on dendritic complexity to modulation of complex processes
as learning and memory. This notion is supported by the fact that drugs that increase
levels of NA at synaptic cleft reverse dendritic atrophy observed in animal models of
depression, and recover cognitive impairment. Considering these antecedents, this
Thesis proposed that: “Activation of β‐adrenergic receptors promotes an increase in
dendritic complexity in primary cultures of hippocampal neurons”. Hippocampal
primary cultures were obtained from embryonic day 18 (E18) Sprague‐Dawley rat
fetuses, and cultured for 7 days in vitro (7DIV). In these cultures, changes in
phosphorylation of cAMP‐response element binding protein (CREB) were evaluated by
Western Blot, in response to short stimulus (5‐15 min) with 100 nM NA in absence and
presence of 10 μM propanolol, a β‐adrenergic receptor antagonist. In addition, levels of
phosphorylated CREB (p‐CREB) were measured by immunocytochemistry, after
stimulation of 2 hours with the same drugs. It was not possible to observe
modifications on signal intensity of p‐CREB through these techniques. However, the
addition of NA promoted an increase in cytosolic calcium, measured by fluorescent
probes for calcium, and a reduction of neuronal activity evaluated by whole‐cell
recording. The 7 DIV cultures showed β2‐adrenergic receptors, which were visualized by Western Blot. Moreover, immunocytochemistry studies showed that β2‐adrenergic
receptor was distributed in neurons mainly in the somato‐dendritic compartment.
Through pharmacological stimulation of cultures for 24 hours with 100 nM NA or 25
nM clenbuterol, with 10 μM propranolol absent or present, the activation of adrenergic
receptors and their role in dendritic morphology has been measured. Morphology was
evaluated through the measurement of intersection points (Sholl Analysis), branching
points, and dendritic length and number. Stimulation with 25 nM clenbuterol did not
have effect on any of these parameters, thus any role of β2‐adrenergic receptors in
dendritic architecture was discarded. Neither administration of NA nor propranolol
alone produced effects on dendrite morphology. However, NA‐stimulated cultures
after incubation with propranolol showed a reduction in the number of intersections in
Sholl analysis compared with controls, in the 30‐80 μm range. Those changes were
accompanied by a reduction in primary dendrites greater than 40 μm, without any
modifications in primary dendrite number per neuron. A similar effect was shown in
secondary dendrites. These results suggest that changes observed in dendritic length
were probably not associated with the activation of β2‐adrenergic receptors. We
propose that the activation of α‐ and β1‐adrenergic receptors may regulate neuron
morphology, probably with opposite effects, controlling dendritic length of longer
primary and secondary dendrites.
The study carried out in this Thesis describes for first time the effects of adrenergic
receptors activation in dendrite morphology, and may explain in part the morphological
changes and cognitive improvement after treatment of drugs that increase levels of NA
in the synaptic cleft
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/115842 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Neira Mora, David Antonio |
| Contributors | Fiedler Temer, Jenny, Rojas Domínguez, Paulina Soledad, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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