A pele é o maior órgão do corpo humano e constitui a principal defesa do organismo contra agentes físicos e químicos, sendo também fundamental para evitar a perda de água por dessecação. Formada por três camadas distintas, mas complementares, sendo as duas principais denominadas derme e epiderme, contendo diferentes tipos celulares, como fibroblastos, queratinócitos, melanócitos, células de Merkel e células de Langerhans, sendo que estas últimas desempenham um papel fundamental na hipersensibilidade de contato. Devido à importância da manutenção da pele saudável para a vida humana, existe uma crescente necessidade da elaboração de substitutos de tecidos para o tratamento de feridos e doentes, assim como, há grande demanda de pele para testes químicos das áreas farmacêutica e cosmética. Outro fator de fundamental importância para o desenvolvimento de métodos alternativos in vitro, é a pressão mundial para que estes testes substituam os modelos animais. Esta abordagem vai de encontro aos novos conceitos de substituição, redução e refinamento na utilização de animais em estudos científicos, ditando o futuro da cultura celular e bioengenharia de tecidos. Graças ao grande desenvolvimento do cultivo celular e descoberta de que as células cultivadas podem ser reagrupadas de acordo com o delineamento experimental, se torna possível à criação de equivalentes dermoepidérmicos para estudos in vitro, como por exemplo, testes de cito e fototoxicidade ou avaliação da fase inicial da reação alérgica e processos de sensibilização da pele. Neste caso, se faz necessária a obtenção de grande quantidade de células de Langerhans imaturas. As células de Langerhans (CLs) são células dendríticas imaturas localizadas na epiderme e epitélio superficial que desempenham um papel central na imunidade da pele, agindo como verdadeiras sentinelas capazes de captar antígenos de contato. Desta forma, foram testados quatro diferentes protocolos para extração e criopreservação destas células, sendo ainda analisadas as suas características morfológicas e fenotípicas. Obtivemos resultados não expressivos quanto ao isolamento, pureza e marcação positiva para CD1a no Protocolo 2 (Expansor de Pele). Os Protocolo 1A (Coleta de Sobrenadante) e 3 (Epiderme + Gradiente de Ficoll Paque) ofereceram altos níveis de células marcadas positivamente para CD1a, apresentando a mesma qualidade de marcação. No entanto, o Protocolo 3 forneceu um maior número de células viáveis, e uma maior pureza da amostra, uma vez que só utiliza a epiderme para a obtenção da suspensão de células, o que o coloca como modelo a ser seguido em posteriores experimentos. Os métodos aqui apontados como mais promissores, podem ser reproduzidos em laboratórios de cultura celular convencionais, contribuindo para aumentar a reprodutibilidade e confiabilidade de resultados experimentais relativos às CLs. Da mesma forma, avaliamos a utilização dos equivalentes de pele humana para a realização de testes in vitro de cito e fototoxicidade, os quais podem de fato reduzir a utilização de modelos animais para identificação do perfil tóxico de uma substância ou de formulações mais complexas. / The skin is the largest organ from the human body and constitutes the main protection of the organism against physical and chemical agents and it is also fundamental to avoid water loss by desiccation. Formed by three distinct stratus, yet complementary, being the two main called dermis and epidermis, containing different cell types, as fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Merkel cells and Langerhans cells (LCs), being these latter fundamental in the contact hypersensitivity. Due to the importance of the healthy skin maintenance to the human´s life, there is a growing need of elaboration of skin models to the treatment of injured and diseased, as well as there is a big demand of skin models to chemical tests from the pharmaceutics and cosmetology fields. Another factor of fundamental importance to the development of alternative in vitro methods is the worldwide pressure for these tests to replace animal models. This approach meets new concepts of replacement, reduction and refinement in the use of animals in scientific studies, dictating the future of cell culture and bioengineering of skin models. Thanks to the large development of cell culture and the discovery that the cultured cells can be regrouped according to the experimental delineation, the creation of skin models to in vitro studies is made possible, as for instance, tests of cytotoxicity and phototoxicity or evaluation of the initial phase from the allergic reaction and processes of skin sensitization. In this case, it is necessary the achievement of a large amount of immature Langerhans cells. The LCs are immature dendritic cells located in the epidermis and superficial epithelium that perform a central role in the skin immunity, acting as real sentinels able to collect contact antigens. Accordingly, were tested four different protocols for extraction and cryopreservation of these cells, and further analyzed its morphological and phenotypic features. We obtained no significant results in relation to the isolation, purity and CD1a positive expression in the Protocol 2. The Protocols 1A and 3 offered high levels of CD1a positively marked cells, showing the same expression levels. However, the Protocol 3 provided a bigger number of viable cells and a high purity yield, since it only uses the epidermis to obtain the single cell suspension, which places it as a model to be followed in subsequent experiments. The methods appointed here as the most promising, can be reproduced in conventional cell culture labs, contributing to increase the reproducibility and reliability of experimental results related to the LCs. In the same way, we evaluated the use of the human skin equivalents to the accomplishment of in vitro tests of cyto and phototoxicity, which can in fact reduce the use of animal models to the identification of single substances toxicity or even complex formulations.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-31102014-140755 |
| Date | 18 September 2014 |
| Creators | Luco, Dayane Piffer |
| Contributors | Mathor, Monica Beatriz |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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