A identificação de isolados dentro de algumas espécies de fungos filamentosos é de interesse médico, agrícola e industrial. Dentro do gênero Metarhizium, por exemplo, a identificação de espécies vêm sendo constantemente modificada devido a análise genética. Nesse contexto, o desenvolvimento de novas estratégias para a identificação rápida e confiável de microrganismos de maneira geral, e de fungos especificamente, é desejável. A espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) tornou-se amplamente difundida na medicina e biologia por fornecer rapidamente informações capazes de caracterizar bioquimicamente uma amostra. Assim, o objetivo desta pesquisa foi utilizar a espectroscopia de FTIR para a caracterização e classificação de linhagens e de espécies dos gêneros Aspergillus e Metarhizium, além da comparação entre diferentes metodologias para classificação. Foram selecionadas duas espécies do gênero Aspergillus: Aspergillus nidulans (ATCC 10074); Aspergillus flavus (ATCC 1410) com conídios verde e branco, obtidas da ATCC \"American Type Culture Collection\"(Manassas, VA), e seis espécies do gênero Metarhizium: Metarhizium acridum (ARSEF 324); Metarhizium acridum (ARSEF 3391); Metarhizium acridum (ARSEF 7486); Metarhizium anisopliae (ARSEF 5749); Metarhizium brunmeum (ARSEF 1095) e Metarhizium brunmeum (ARSEF 5626), obtidas da \"USDA-ARSEF collection of Entomopathogenic Fungal Cultures\"(U.S. Plant, Soil and Nutrition Laboratory, Ithaca, NY). O cultivo de todas as espécies foi feito em laboratório. As espécies A. nidulans ATCC 10074 e M. acridum ARSEF324 foram usadas para avaliar a influência da luz e do pH do meio de cultura sobre o crescimento dos fungos. Os valores de pH do meio estudados variaram ente 5 e 8. Para obter os espectros de absorção, os conídios foram delicadamente retirados e depositados sobre o cristal de ATR do espectrômetro do FTIR. Os espectros foram normalizados vetorialmente e subdivididos em quatro intervalos: 910-1178 cm-1 , 1178-1490 cm-1 , 1490-1790 cm-1 e 2810-2990 cm-1 . Parâmetros espectroscópicos como o deslocamento do pico de absorção e as razões entre áreas sob as bandas foram calculadas para todos os espectros coletados. O teste estatístico t-Student foi aplicado a estes parâmetros para diferenciar as amostras. Ambas as análises foram realizadas pelo programa Origin 8.5. A análise de componentes principais e agrupamento foram realizada usando o programa Minitab 16. As técnicas utilizadas para análise foram capazes de diferenciar as amostras de Aspergillus crescidas na presença e na ausência de luz, mas o mesmo não foi possível para o Metarhizium. Dentre os valores de pH do meio de cultura foi possível apenas a diferenciação do pH 8. O A. flavus com conídios brancos e verdes foram diferenciados entre si assim como entre eles e os A. nidulans. Entre as espécies foi possível obter a classificação de acordo com a taxonomia através da região espectral 1178-1490 cm-1. As quatro metodologias foram consideradas adequadas para análise dos espectros de absorção, entretanto o deslocamento de pico e a razão entre as áreas são viáveis apenas para um número pequeno de amostras enquanto o PCA e o cluster são viáveis para um número grande de amostras. / The identification of isolates within some species of filamentous fungi has medical, agricultural and industrial interest. Within the genus Metarhizium, for example, species identification is being constantly changed due to genetic analysis. In this context, the development of new strategies for the rapid and reliable identification of microorganisms in general, and specifically of fungi is desirable. Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) has become widespread in medicine and biology by providing information quickly able to biochemically characterize a sample. The aim of this research was to use FTIR spectroscopy for characterization and classification of strains and species of the genera Aspergillus and Metarhizium and compare different methods for classification. We selected two strains of the genus Aspergillus: Aspergillus nidulans (ATCC 10074), Aspergillus flavus (ATCC 1410) with green and white conidia, obtained from ATCC \"American Type Culture Collection\"(Manassas, VA), and six strains of Metarhizium: Metarhizium acridum (ARSEF 324); Metarhizium acridum (ARSEF 3391); Metarhizium acridum (ARSEF 7486), Metarhizium anisopliae (ARSEF 5749); Metarhizium brunmeum (ARSEF 1095) and Metarhizium brunmeum (ARSEF 5626), obtained the \"USDA-ARSEF collection of Entomopathogenic Fungal Cultures \"(U.S. Plant, Soil and Nutrition Laboratory, Ithaca, NY). The cultivation of all species were made in the laboratory. The species A. nidulans (ATCC 10074) and M. acridum (ARSEF 324) were used to evaluate the influence of light and pH of the culture medium on the growth of fungi. The pH values of the medium studied ranged between 5 and 8. To obtain the absorption spectra, the conidia were gently removed and deposited on the ATR crystal of FTIR spectrometer. The absorption spectra were vector normalized and divided in four ranges: 910-1178 cm-1, 1178-1490cm-1, 1490-1790cm-1 and 2810-2990cm-1. Spectroscopic parameters as the displacement of the absorption peak and the ratios of the areas under the bands were calculated for all spectra collected. The statistical test t-Student was applied on these parameters to differentiate the samples. Both analyzes were performed by the program Origin 8.5. The principal component analysis and cluster analysis were performed using Minitab 16. The techniques used for analysis were able to differentiate samples of Aspergillus grown in the presence and absence of light, but it was not possible to Metarhizium. Among the pH of the culture medium was only possible to identify the pH 8. The A. flavus with white and green conidia were differentiated among themselves and between them and the A. nidulans. Among the strains of the same specie it was possible to obtain the correct classification according to the taxonomy through spectral region 1178-1490 cm-1. The four methods were considered appropriate for the analysis of absorption spectra, however displacement of the absorption peak and the ratios of the areas are feasible for a small number of samples and the multivariate analysis are feasible for a large number of samples.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-31012013-094052 |
| Date | 08 November 2012 |
| Creators | Batistuti, Marina Ribeiro |
| Contributors | Bachmann, Luciano |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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